Prime editing teknolojisi kullanılarak kronik myeloid lösemi hücre hattında BCR-ABL füzyon geninin terapötik amaçlı düzenlenmesi

Amaç: Prime Editing (PE) yöntemi,CRISPR-Cas teknolojileri arasında yer alan, yüksek verimlilik ve seçilen diziye yüksek spesifiklik gösteren,gen düzenleme alanındaki yeni yaklaşımlardan biridir.Bu çalışmada K562 hücre dizisinde PE uygulanması ve bu doğrultuda Kronik Myeloid Lösemi (KML) hastalığının,BCR-ABL1 füzyon onkogeninde güncel yaklaşımlardan farklı bir yaklaşım denenerek genetik düzenleme ile hastalığın tedavisine yönelik gen terapi alanına yeni bir strateji sunulması amaçlanmıştır. Gereç ve Yöntem: Bu çalışmada KML patogenezinin temel mekanizması olan BCR-ABL1 füzyonunu hedefleyen özgün bir yöntem geliştirilmiştir.K562 hücre dizisi kullanılarak translasyonu sonlandıracak spesifik bir terminasyon sekansının BCR-ABL1 birleşim noktasına eklenmesi amaçlanmıştır.Öncelikle hedef bölge dizisi belirlenmiştir.Çalışmanın en spesifik parçası olan epegRNA molekülünün tasarımı yapılmıştır.Golden Gate Klonlama yöntemi kullanılarak epegRNA sentezi gerçekleştirilmiştir.epegRNA'nın vektöre ligasyonu gerçekleştirilmiştir.Transformasyon ve transfeksiyon işlemleri uygulanmıştır.PE verimlilik oranı,Yeni Nesil Dizileme (YND) yöntemi ile iki farklı ve birbirini tamamlayan biyoinformatik yaklaşım ile analiz edilmiştir.Öncelikle P2 primer seti ile toplam wild-type (WT) alel popülasyonu belirlenmiştir.Sonraki basamakta özel olarak tasarlanmış P3 primer seti ile sadece düzenlenmiş alellerin zenginleştirilerek çoğaltılması sağlanmıştır.YND'den elde edilen ham veriler,hem özel komut dosyalarıyla doğrudan sayılarak hem de özel oluşturulmuş referans dizilere hizalanarak Integrative Genomics Viewer (IGV) ile doğrulanmıştır. Bulgular: Düzenleme verimliliği,%10.64 olarak hesaplanmıştır.Standart YND analizinin, negatif Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR) yanlılığı nedeniyle düşük frekanslı düzenlemeleri tespit etmede yetersiz kaldığı gösterilmiştir.Bu sınırlılığı aşmak için,sadece düzenlenmiş alelleri zenginleştiren seçici bir PZR yaklaşımı uygulanmıştır.Bu sayede, düzenleme oranı hassas bir şekilde hesaplanmıştır.Her iki aşamadan elde edilen verilerin entegrasyonu,hem düzenlemenin yüksek doğrulukla gerçekleştiğini doğrulamış hem de popülasyondaki düzenleme oranının güvenilir bir şekilde belirlenmesini sağlamıştır. Sonuç: Sonuç olarak,bu tez çalışması,onkojenik BCR-ABL1 füzyon genini ilk kez PE teknolojisi ile hedefleyerek,KML için kalıcı bir tedavi potansiyeli sunan yeni ve özgün bir yaklaşım ortaya koymuştur.K562 hücre hattında %10.64 verimlilikle başarılı bir düzenleme sağlandığı gösterilmiş ve bu düşük frekanslı düzenlemelerin tespiti için standart yöntemlerin yetersizliğini aşan iki aşamalı özgün bir NGS analiz yöntemi geliştirilmiştir.Elde edilen bu oran,zor düzenlenebilir kabul edilen K562 hücre hattında,anlamlı bir başlangıç noktası olarak yorumlanmıştır.Bu umut verici sonuçlar,PE teknolojisinin yüksek özgünlüğü ve güvenliği ile birleştiğinde,düzenleme verimliliğinin artırılması ve in vivo modellere taşınması gibi gelecek çalışmalar için sağlam bir temel oluşturmakta ve bu yaklaşımın KML tedavisinde kalıcı bir çözüm sunma vaadini güçlendirmektedir.