Aspergillus fumigatus HBF125 ekstraselüler α-amilazının üretimi, saflaştırılması ve karakterizasyonu

Çalışmamızda, 91 fungusun sıcaklık sınırları ve endüstriyel enzimlerinin taraması yapıldı. Termotolerant ve termofilik funguslardan en iyi amilaz aktivitesi gösteren Aspergillus fumigatus HBF 125 suşu seçildi. Bu fungusun kültür koşullarının optimizasyonu yapıldı. A. fumigatus HBF125 suşunun en yüksek enzim üretimi için 7 günlük sporulasyon ortamı, %5 inokulum oranı, sıcaklık 35 °C, başlangıç pH 5.0 ve karbon kaynağı %1.5 kepek olarak bulundu. Optimum büyüme ortamında A. fumigatus HBF125 tarafından üretilen ekstaselüler amilaz, nişasta affinite kromatografisi ile %4.7 verimle 54.4 kat saflaştırıldı. Enzimin molekül ağırlığı SDS-PAGE ile 160 kDa olduğu hesaplandı. Enzimin iki alt ünitesi olduğu molekül ağırlıklarının 86.2 ve 73.8 kDa olduğu hesaplandı. Optimum sıcaklığı 60 °C, optimum pH'sı 5.5 olarak bulundu. Enzimin geniş pH (pH 4.0-8.0) ve sıcaklık (25-60 °C) aralığında stabil olduğu saptandı. Amilazın Km değeri 1.43 mg/mL, Vmax değeri ise 909 U/mL bulundu. Ayrıca amilaz geniş bir substrat spesifitesine sahip olduğu saptandı. Enzim aktivitesinin NBS varlığında kuvvetli bir şekilde inhibe olduğu, bu nedenle katalitik işlemde triptofan kalıntılarının önemli rol oynadığı ileri sürüldü. Tween 20 gibi deterjanlardan enzim aktivitesinin etkilenmediği, ancak 1.4-dioksan ve n-propanol tarafından enzimin inhibe olduğu saptandı. Enzim Mn2+, Co2+, Ca2+ ve Ba2+ tarafından aktive edilirken, Hg2+ tarafından kuvvetli bir şekilde inhibe edildi. Enzimin tuz toleransının çok iyi olduğu belirlendi. Amilazın metalloenzim olduğu saptandı.