Prolil endopeptidaz (PEP) enziminin Escherichia coli ekspresyon sisteminde çözünür formda eldesi, saflaştırılması ve karakterizasyonu

Prolil endopeptidaz serin peptidaz sınıfına ait büyük bir sitosolik enzimdir ve sık olarak kültürlenen bir mikroorganizma olan Aspergillus niger'den izole edilmiştir. Prolil endopeptidaz, prolin bakımından zengin prolaminleri parçalama ve enflamatuar reaksiyonu inhibe etme yeteneklerinden dolayı umut verici bir terapötik ajandır. Günümüzde çölyak hastalığının tedavisinde prolil endopeptidaz enziminin oral yoldan verilmesinin etkili bir strateji olacağı düşünülmektedir. Bu şekilde yapılan tedavinin amacı prolil endopeptidazın mide asitleri tarafından parçalanmasını önlemek ve ince bağırsakta etkili olmasını sağlamaktır. Üretilmesi hedeflenen prolil endopeptidaz enziminin Escherichia coli'de rekombinant üretimi esnasında bazı problemler meydana gelmektedir. İnklüzyon cisimcikleri Escherichia coli'de prolil endopeptidaz enziminin yüksek seviyede ekspresyonu sırasında oluşmaktadır. Rekombinant protein üretimi sırasında meydana gelen inklüzyon cisimciklerinden proteinin yeniden kazanılması için kullanılan stratejiler uzun süre alabilmekte ve uygulamada çeşitli zorluklar içermektedir. Bu tez kapsamında prolil endepeptidaz enziminin ekspresyonu için Escherichia coli BL21 (DE3) hücreleri kullanılmıştır. Beş şaperon plazmid sistemi kullanılarak (pG-KJE8, pGro7, pKJE7, pG-Tf2, pTf16) prolil endopeptidaz enziminin inklüzyon cisimcikleri oluşturması engellenip çözünür formda üretimi sağlanmaya çalışılmıştır. Yapılan deneyler sonucunda pKJE7 plazmidinin, prolil endopeptidaz enziminin çözünür formda üretimine bir miktar yardımcı olduğu gözlenmiştir. Prolil endopeptidaz enziminin aktivite çalışmaları spektrofotometrik analiz kullanılarak gerçekleştirilmiş olup prolil endopeptidaz enziminin Km değeri 2,06 mM ve Vm 0,0359 mM/sn olarak bulunmuştur.