Bilgisayar yaklaşımı ile Chloroflexus agregans'tan elde edilen termostabil lov domaın üzerindeki prolin ikamelerinin etkisi

Işık-Oksijen-Voltaj (LOV) alanları bitkilerde, bakterilerde ve mantarlarda bulunan ve flavinleri kromofor olarak bağlayan ve mavi ışığı algılayan fotoreseptörlerin korunmuş parçalarıdır. Geçmişte, LOV alanı varyantları, anaerobik koşullar altında floresanları, hızlı katlanan kinetikleri ve küçük boyutları ∼12-16 kDa olan floresan raportör proteinler (flavin bazlı floresan proteinler; FbFP'ler olarak adlandırılır) olarak geliştirilmiştir. CagFbFP, termofilik bakteri Chloroflexus agreganlarından çözünür bir LOV alanı içeren histidin kinazdan türetilen, ısıya dayanıklı küçük bir flavin bazlı floresan protein olarak sunulur. CagFbFP 107 amino asitten oluşur, moleküler ağırlığı 11.6 kDa'dır ve sadece korunmuş LOV çekirdek alanından oluşur. CagFbFP, moleküler ağırlığı ∼25 kDa olan bir dimerdir. Termofilik mikroplarda bir floresan raportör olarak kullanım için floresan proteinlerin artan termostabilitesi bile arzu edilen bir özelliktir, ilk FbFP'ler orta sıcaklıklarda açılır. İlginç bir şekilde, CagFbFP şu anda açıklanan FbFP proteinlerinin en kısası olmasına rağmen, yine de dikkate değer bir termal stabiliteye sahiptir. Bu çalışmada, doğal olarak ısıya dayanıklı protein CagFbFP'nin rasyonel mühendislik kullanılarak daha da stabilize edilip edilemeyeceğini sorguladık. Bu çalışmada şu anda kullanılan protein stabilizasyonuna yönelik farklı yaklaşımlardan prolin ikamesini konsensüs tasarımıyla birleştirmeyi seçtik. Prolin ikamesi için üç bölge ve elde edilen varyantların termal stabilitesi belirlendi. Bu çalışmanın deneysel kısmına göre, A95P mutantının erime sıcaklığı yaklaşık 2 °C yükseltilirken, A56P ve A58P mutasyonları nötrdür. Daha sonra, A56P ve A95P varyantları kristalleştirildi ve A58P mutasyonunun etkilerini modelledi ve yapılarının ana proteine kıyasla korunduğu belirlendi.