Proteaz profillendirmesi için afinite materyallerinin hazırlanması

Proteazlar, aktiviteleri ve ekspresyonları açısından, kardiyovasküler hastalıklar, enflamasyon, kanser, osteoporoz ve nörolojik bozukluklar gibi birçok patolojik durum ile ilişkilendirilmiş proteolitik enzimler olup, önemli ilaç hedefleri olarak görülmektedir. Bu nedenle proteazların değişen koşullarda belirlenmesi önemlidir ve sonrasında ise lokalizasyonlarının, biyolojik fonksiyonlarının, aktivite ve regülasyon mekanizmalarının, yapı fonksiyon ilişkilerinin iyi anlaşılması gerekmektedir. Bu ise dinamik koşullarda proteazların profillendirilmesi ile mümkündür. Bu çalışmada kompleks proteomda farklı proteaz sınıflarına yönelik serin, sistein ve metalloproteazların profillendirilmesinde kullanılabilecek afinite materyallerinin hazırlanması, karakterizasyonu ve uygulamaları hedeflendi. Bu amaçla, yumurta akı protein yapısında proteaz inhibitörleri ve zengin protein içermesi sebebiyle afinite materyali hazırlanmasında kaynak olarak seçildi. Proteaz spesifik afinite materyalleri elde etmek için, taşıyıcıya bağlama, çöktürme ve glutaraldehit ile çapraz bağlama gibi çeşitli yöntemler denendi ve aseton çöktürmesi sonrası çapraz bağlama yöntemi afinite materyali hazırlanmasında kullanılmak için en uygun yöntem olarak belirlendi. Elde edilen materyal Yumurta Akı Proteini Tabanlı Polimer (YA-PTP) olarak isimlendirildi. YA-PTP'in hazırlanmasında kullanılan glutaraldehit konsantrasyonu % 0,5 (v/v) olarak optimize edildi ve proteaz bağlama etkinliği farklı proteazlar kullanılarak çalışıldı. YA-PTP, karışık sindirim enzimleri içeren pankreatin proteazları, tripsin (serin proteaz) ve papaini (sistein proteaz) etkin olarak bağladığı görüldü. İleri aşamada optimizasyon çalışmaları tripsin, papain ve pankreatin üzerinden gerçekleştirildi. YA-PTP'in proteaz bağlama kapasitesi pankreatin, tripsin ve papain için sırasıyla 38, 60 ve 70 mg/g polimer olarak bulundu. YA-PTP'e proteaz bağlanması için optimum bağlanma ortamı 25 mM NaCl içeren 50 mM, pH 6,0 sodyum fosfat tamponu ve maksimum proteaz bağlanma süresi de 20 dakika olarak belirlendi. Serbest, enzim bağlı ve enzim uzaklaştırılmış polimerin yüzey morfolojisi Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM) kullanılarak incelendi ve polimere proteaz bağlanmasının polimer yüzeyinde morfolojik değişikliklere sebep olduğu görüldü. YA-PTP'in spesifik proteaz bağlama etkinliği SDS-PAGE (Sodyum Dodesil Sülfat Poliakrilamid Jel Elektroforezi) ve aktiviteye dayalı difüzyon agar plate yöntemleri ile irdelendi. Polimere uygulanan ve polimerden elüe edilen enzimlerin SDS-PAGE analizleri ve farklı substratlar ve inhibitörler varlığında uygulanan difüzyon agar plate aktivite testleri ile YA-PTP'in proteaz spesifik bağlama etkinliği kanıtlandı. Sonuç olarak elde edilen yumurta akı proteini tabanlı polimer (YA-PTP)'in proteaz bağlanmasına spesifik olduğu ve proteazlarının profillendirilmesi ve saflaştırılması için uygun ve düşük maliyetli bir materyal olabileceği düşünüldü. Bu tez çalışmasında, hazırlanan materyalin gerek proteomik gerek degradomik çalışmalarda ön fraksiyonlama/zenginleştirme materyali olarak kullanımlarının yanısıra farklı kaynaklardan proteaz saflaştırmada kullanılabilecek yüksek spesifiklikte ve yüksek kapasiteli bir materyal olması nedeniyle, varolan literatüre katkı sağlayarak ileri düzeydeki çalışmalara ışık tutacağı açıktır.