İnsan somatik hücre yeniden programlamasında deubiquitinating enzim USP22'nin rolü

OCT4, SOX2, KLF4 ve MYC (OSKM) anlatımıyla insan somatik hücreleri indüklenmiş pluripotent kök hücrelere (iPKH) yeniden programlanabilir. Yeniden programlamaya engel hücre içi mekanizmalar mevcuttur. Kromatin yolaklarından yeniden programlamaya engel olacakları bulmak için CRISPR-Cas9 ile susturma taraması yaptık. DNMT3A ve EP300 gibi yeniden programlamaya bariyer olduğu bilinen genlerin dışında bu tarama USP22 için de bariyer rol belirlemiştir. Bu tezde fonksiyon kaybı yöntemiyle USP22'nin bariyer rolü teyit edilmiştir. Bunun üstüne, USP22'nin farklı mutantlarının anlatımıyla, USP22'nin katalitik aktivitesinin ve SAGA kompleksine katılımının yeniden programlama üzerinde bir etkisi olmadığı ortaya çıkmıştır. İlgi çekici olarak, ATXN7L3 ve ENY2 gibi SAGA DUB modülüne ait genler CRISPR-Cas9 metoduyla susturulduğunda, yeniden programlama verimi üzerinde herhangi bir olumlu etkisi görülmemiştir. USP22'nin insan pluripotensisi üzerindeki etkisini araştırmak için USP22 geni susturulmuş tek hücreden büyüyen klonlar elde edilmiştir. Bu klonlar tıpkı kontrol klonları gibi pluripotensi belirteçlerinin anlatımını sağlamış, teratom oluştururken üç embriyonik tabakadan dokulara farklılaşabilmiş ve normal karyotip göstermişlerdir. Belirli tabakalara farklılaşmadaki hataları anlamak için bu klonlar in vitro farklılaşmaya maruz bırakılmışlardır. OCT4 ve SOX2 gibi pluripotensi belirteçlerinin basarisiz bir şekilde düşmesiyle, plurpotensiden çıkışta problemler saptanmıştır. Dahası, mezoderm ve endoderm farklılaşmada USP22 susturulmuş klonlarda belirteçlerin daha düşük anlatımı olduğu için problemler saptanmıştır. USP22'nin susturulmasıyla artan yeniden programlama verimi hakkında daha mekanistik bilgi kazanmak için RNA-dizileme yapılmıştır. USP22 geni susturulmuş ve kontrol fibroblastlar OSKM anlatımıyla yeniden programlanmış ve 6. günde RNA-dizileme yapılmıştır. Beklendiği üzere, gelişim ile ilgili gen setleri USP22'nin silinmesiyle negatife korele olurken pluripotensi ile ilgili gen setleri pozitif korele olmuştur. SOX2 hedef genleri pozitif korele olan gen setlerinden biriydi ve biz USP22'nin silinmesiyle endojen pluripotensi ağı yeniden programlamada daha erken aktive olarak verimi arttırmaktadır diye hipotez geliştirdik. Bu hipotezi test etmek için yeniden programlamanın farklı günlerinde RNA toplanarak endojen SOX2 seviyesinin kontrole göre 3 kata kadar arttığı gösterilmiştir. Bu sonuçlar USP22'nin endojen plurpotensi ağını katalitik aktivitesi ve SAGA'dan bağımsız olarak baskılayarak yeniden programlamaya engel olduğunu göstermiştir.