Sıcaklığa dirençli amilaz genlerinin klonlanması üzerine çalışmalar

ÖZDOKTORA TEZİSICAKLIĞA DİRENÇLİ AMİLAZ GENLERİNİNKLONLANMASI ÜZERİNE ÇALIŞMALARBahri Devrim ÖZCANÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİFEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜZOOTEKNİ ANABİLİM DALIDanışman : Prof.Dr. Numan ÖZCANYıl: 2005, Sayfa: 122Jüri : Prof.Dr. Numan ÖZCANProf.Dr. Hasan Rüştü KUTLUProf.Dr. Halil KASAPProf.Dr. Mehmet TOPAKTAŞDoç.Dr. Mehmet Sait EKİNCİYapılan bu çalışma ile Bacillus stearothermophilus'a ait sıcaklığa dirençli α-amilaz genini taşıyanpC194α rekombinant vektörü, Bacillus subtilis YB886 ve Bacillus subtilis BR151 suşlarına elektroporasyontekniği ile aktarılmıştır. α-amilaz enziminin konakçıda hücre dışına salındığı gerek nişasta içeren LB/Agarbesiyerlerinde, gerekse SDS-Nişasta-PAGE'de zymogram analizleri ile gösterilmiştir. Ayrıca rekombinantbakterilerden izole edilen rekombinant plazmidlerin Hind III enzimi ile kesimi sonucu agaroz jelde 5.25 kbç'liksıcaklığa dirençli α-amilaz genini taşıyan DNA bandı ile 2.9 kbç'lik pC194 bandı gözlenmiştir. Rekombinant B.subtilis suşlarına ait hücre dışı sıvılarının 80 ºC'de 15 dakika inkübasyonu ile B. subtilis kökenli mezofilikproteinler denatüre edilirken, sıcaklığa dirençli α-amilaz enziminden sorumlu bant SDS-PAGE ve SDS-Nişasta-PAGE'de gösterilmiştir.Diğer taraftan sıcaklığa dirençli β-amilaz geni Thermoanaerobacterium thermosulfurogenesDNA'sından PCR tekniği ile izole edilerek pBluescript II KS/SK, pL2 ve pNW33N klonlama vektörleri ileEscherichia coli'de, pUB110 klonlama vektörü ile de Bacillus subtilis BR151 ve Bacillus amyloliquefaciensbakterilerinde klonlanmıştır. Rekombinant bakterilerden izole edilen plazmidlerin Bam HI enzimi ile kesilip β-amilaz genine ait 1.935 kbç'lik DNA parçasının agaroz jelde gösterilmesiyle gen entegrasyonunun tamamlandığıanlaşılmıştır. LB/Nişasta/Agar plaklarına ekilen rekombinant Escherichia coli kolonilerinin I2 boyaması sonucupozitif zon vermesi ile üretilen proteinin aktif olduğu tespit edilmiştir. Ayrıca rekombinant vektörler kalıp olarakkullanılmış ve sıcaklığa dirençli β-amilaz geni PCR ile çoğaltılarak elde edilen ürün agaroz jelde gösterilmiştir.Buna ilaveten, elde edilen PCR ürününün Hind III enzimi ile kesilmesi sonucu elde edilen yaklaşık 1.5 ve 0.5kbç'lik fragmentlerin agaroz jel elektroforezde gösterilmesi genin klonlanmasına yönelik bulguları dadesteklemiştir. Fakat sıcaklığa dirençli β-amilaz geni B. subtilis BR151 ve B. amyloliquefaciens'deklonlanmasına karşın LB/Nişasta/Agar plaklarında enzim aktivitesi görülmemiştir. Buna karşılık hücre dışıenzimlerin denatüre edilerek SDS-Nişasta-PAGE'de elektroforezi ve arkasından tekrar renatüre edilerekortamdaki substratı parçalaması sonucu zymogram analizinde enzimatik aktivite görülmüştür.Anahtar Kelimeler: Bacillus stearothermophilus, Thermoanaerobacterium thermosulfurogenes, α-amilaz, β-amilaz, KlonlamaI