Semen örneklerinde miR-891a ve miR-10a belirteçlerinin çeşitli koşullarda dayanıklılığının değerlendirilmesi

Adli soruşturmalarda biyolojik deliller, faillerin tespiti ve suç faaliyetlerinin ardındaki gerçeğin ortaya çıkarılması açısından büyük önem taşımaktadır. Sağlık alanındaki teknolojik gelişmeler ile birlikte biyolojik örneklerden DNA analizinin yapılması mümkün olmuş ve hukuki açıdan daha kesin ve güvenilir sonuçlar elde edilmesini sağlamıştır. Günümüzde olay yerinden toplanan örneklerden DNA analizi yapılmadan önce insan kaynaklı bir biyolojik örnek olduğunun kesinleşmesi gerekmektedir. Bunun için geliştirilmiş çeşitli fiziksel, immünolojik, histo-kimyasal, mikroskobik testler bulunmaktadır. Ancak bu testler, eser miktardaki örneklerle çalışıldığında, örnek içerisindeki DNA yapısının bozulmasına ve örnek miktarında azalmaya sebep olabilmektedir. Ayrıca yeterince spesifik olmayan testlerde yanlış pozitif veya yanlış negatif sonuçlar elde etmek mümkündür. Tüm bu dezavantajlar göz önüne alındığında adli bilimlerde yeni nesil moleküler uygulamalara başvurulmuştur. Doku spesifik ekspresyon özellikleri nedeniyle RNA molekülleri, bu testlere alternatif olarak öne sürülmüştür. Tıpkı mRNA gibi miRNA'lar da doku spesifik ekspresyon özellikleri nedeniyle vücut sıvısı tayininde kullanılmaya uygun moleküllerdir. miRNA'lar daha küçük boyutları ve enzim kompleksiyle korunmasından dolayı mRNA'lara göre daha dayanıklı ve stabil moleküllerdir. Bu nedenle degrade koşullarda daha iyi sonuç vermektedir. Olay yerindeki degrade edici koşulların özellikleri göz önüne alındığında, bu tür belirteçlerin bu ortamlarda stabilitelerinin değerlendirilmesi adli bilimler için oldukça önemlidir. Bu sebeple çalışmamızda en sık karşılaşılan olay yeri senaryoları belirlenerek, bu koşullar üzerinde denemeler yapılmıştır. Çalışmamızda, özellikle cinsel suçlarda önemli bir yer tutan bir biyolojik sıvı olan semen üzerinde, diğer vücut sıvılardan ayırt edici bir şekilde yüksek konsantrasyonlarda bulunan miR-10a ve miR-891a belirteçlerinin, degrade edici koşullarda stabiliteleri değerlendirilmiştir. Semen örnekleri gönüllülük esası ile çalışmaya katılan beş sağlıklı (normospermi) bireyden toplanmıştır. Her bir bireyden alınan semen örneği, %100 pamuklu beyaz kumaşlara damlatılmış ve bu kumaşlar olay yerleri taklit edilerek oluşturulan koşullarda bekletilmiştir. Kontrol grubu olarak kullanılan O grubu örnekleri oda sıcaklığında, S grubu örnekleri Büyükçekmece gölünden alınan su içerisinde, T grubu örnekleri standart bahçe toprağında gömülü olacak şekilde 20 gün bekletilmiştir. Y grubu örnekleri, ev tipi çamaşır makinesi içerisinde 90 °C yıkama programında 1 saat toz deterjanla birlikte yıkanmıştır. Kumaş örneklerinden, hedeflenen süre sonunda total RNA izolasyonu yapılmıştır. RNA izolasyonunun ardından cDNA sentezi gerçekleştirilmiştir. Kantitatif analiz için RT-PCR cihazında miR-10a ve miR-891a bölgelerinin amplifikasyonu gerçek zamanlı olarak görüntülenmiş ve Ct değeri elde edilmiştir. Karşılaştırma için referans olarak RNU6b kullanılmıştır. miRNA konstantrasyon karşılaştırmaları için ΔCt [Ct(miRNA) – Ct (RNU6b)] ve ΔΔCt değerleri hesaplanmış ve miR-10a ile miR-891a stabiliteleri, 2-ΔΔCt formülüyle hesaplanan kat değişimi (fold change) prensibiyle yorumlanmıştır. Ct değeri 35 ve üstü çıkan örnekler için kat değişimi ve istatistiksel analizler uygulanmamıştır. Kat değişimi verilerine göre miR-891a ekspresyonunun, miR-10a'ya göre daha fazla olduğu ve daha stabil bir belirteç olduğu yorumlanmıştır. Çamaşır makinesinde yıkanan örneklerde ise ortam sıcaklığının fazla olması ve çamaşır deterjanı gibi nükleik asit yapısına zarar veren kimyasalların bulunmasından dolayı miRNA degradasyonu daha fazla gerçekleşmiştir ve bu grupta miRNA eldesi yapılamadığı için karşılaştırmalı analizlere dahil edilmemiştir. İstatistiksel analizler için IBM SPSS Statistics 22 programı ile farklı çevresel koşulların, miRNA konsantrasyonunda anlamlı bir fark yaratıp yaratmadığının belirlenmesi için normallik testi (Shapiro–Wilk) ve One-way ANOVA ve Post-hoc Tukey ile test edilmiştir. One-way ANOVA testi sonuçlarına göre test edilen çevresel koşullar, miRNA stabilitesi üzerinde anlamlı bir etkiye sahip değildir (p>0,05).