Serratia marcescens GBS19 izolatına ait kitinaz A gen bölgesinin klonlanması, ekspresyonu, saflaştırılması ve tarım zararlısı Myzus persicae üzerine insektisidal akitivitesinin incelenmesi

Entomopatojen olma potansiyelindeki mikroorganizmaların ürettiği birtakım enzimlerin biyolojik mücadele ve kontrol amaçlı kullanılma durumu, hedeflenmiş organizma haricinde diğer canlılar açısından güvenli olması gibi birçok avantaja sahiptir. Bu tez çalışması, kitinazın biyolojik mücadelede kullanımının biyolojik ve çevre dostu bir çözüm önerisi olarak ortaya koymasını amaçlamıştır. Gerçekleştirilen tez çalışmasında kullanılan yöntemler olarak, S. marcescens GBS19 genomu içerisinde bulunan chiA gen bölgesi, spesifik primerler kullanilarak PCR ile çoğaltılmıştır. Çoğaltılan gen bölgesi pBluescript II KS (+) klonlama vektörüne klonlanmış ve sekans analizi yapılmıştır. Sekans analizi ile doğrulanan chiA geni pET-22b (+) ekspresyon vektörüne klonlanmıştır ve Escherichia coli BL21(DE3)'de protein eksprese edilmiştir. Ekspresyonu sağlanan chiA proteini his-taq afinite kromotografisi kullanılarak saflaştırılmışve SDS-PAGE ile görüntülenmiştir. SDS-PAGE sonucunda beklendiği üzere 62.5 kDA'lık protein bandı görülmüştür. Aynı zamanda protein ekspresyonu qPCR kullanılarak doğrulanmıştır. Elde edilen chiA enziminin en iyi çalıştığı sıcaklık ve pH düzeylerine bakılmıştır. Elde edilen sonuca göre enzimin çalıştığı en iyi sıcaklık 40°C, en iyi pH ise 5 olarak bulunmuştur. Enzimin çalıştığı optimum koşullar belirlendikten sonra tarım zararlısı Myzus persicae üzerine insektisidal aktivitesi çalışılmıştır. Saf chiA enziminin LD50 değeri 15.804 ppm bulunmuştur. Biyoinformatik modelleme hesaplamalı biyoloji yöntemleri kullanılarak enzimin substrat olan kitin ile arasındaki bağlanmanın en yüksek -4.10 kcal/mol olduğuda tespit edilmiştir. chiA enzimi, NCBI veritabanında bulunan ref_seq chiA enzimleri ile karşılaştırıldığında en yakın olduğu kitinaz kodlayan aminoasitlere %98,93 oranında benzerlik gösterdiği belirlenmiştir.