Hedefe yönelik yaklaşimlar ile lizozomal ekzositozun epigenetik düzenlenmesinin i̇laç duyarliliği ve transkripsiyonel aktivasyon üzerindeki etkilerinin i̇ncelenmesi

Birçok solid tümörde kemoterapinin sınırlı etkinliği, sıklıkla hücre içi ilaç birikimini azaltan hücresel mekanizmalardan kaynaklanır. Bu mekanizmalardan biri, lizozomal hapsolma ve bunu takip eden ekzositozdur; bu süreçte kemoterapötik ajanlar asidik veziküller içinde hapsedilir ve hücre dışına atılarak sitotoksik etkinlikleri sınırlandırılır. Bu mekanizma tedavi başarısızlığına sebebiyet veren bir süreç olarak giderek daha fazla tanınsa da, söz konusu olayı düzenleyen mekanistik regülasyonlar hâlâ yeterince aydınlatılamamıştır. Özellikle, kromatin düzenleyici enzimlerin lizozomal dinamikleri nasıl kontrol ettiği sistematik olarak araştırılmamıştır. Bu tez, lizozomal ekzositozun epigenetik bir düzenlemeye tabi olabileceği ve belirli kromatin düzenleyici enzimlerin farmakolojik inhibisyonunun vezikül aracılı ilaç uzaklaştırımını baskılayabileceği hipotezini araştırmaktadır. Bu amaçla, 175 küçük molekül inhibitör içeren hedefe yönelik bir epigenetik ilaç (epi-ilaç) kütüphanesi taranmış ve lizozomal ekzositoz, vezikül birikimi ve sisplatin duyarlılığı üzerinde etkili bileşikler belirlenmiştir. Tip I protein arjinin metiltransferazlarını (PRMT'ler) hedefleyen iki inhibitör güçlü adaylar olarak öne çıkmış ve kendileri bazal toksisite oluşturmaksızın sisplatin sitotoksisitesini anlamlı düzeyde artırmıştır. Bu inhibitörler, lizozomal ekzositozu azaltmış ve Hücre içindeki lizozomal içeriği artırmıştır; üstelik bu etkiler lizozomal biyogenezden sorumlu kanonik regülasyon ve buna ait transkripsiyon faktörlerinden bağımsız olarak gerçekleşmiştir. PRMT inhibisyonunu takiben yapılan transkriptom analizleri, kromatin bakımı ve DNA onarım yollarının baskılandığını, oksidatif stres ve apoptoz ile ilişkili genlerin ise arttığını göstermiştir. Gen seti zenginleştirme analizleri, PRMT inhibisyonunun lizozomal dinamikler üzerindeki etkisini destekler nitelikte, vezikül aracılı taşıma ve lizozomal enzimlerin düzenlenmesi gibi lizozomla ilişkili yolların zenginleştiğini de ortaya koymuştur. Çevrimiçi erişilebilir ChIP-seq verileriyle yapılan entegrasyon, farklı şekilde eksprese edilen genlerin birçoğunun doğrudan PRMT hedefi olduğunu göstermiş ve bu genlerin promotör bölgelerinde PRMT bağlanmasının varlığı ChIP-qPCR deneyleriyle doğrulanmıştır. Tüm bu bulgular birden fazla hücre hattında doğrulanmış ve lizozomal olarak hapsedilen diğer ilaçlara da genellenerek terapötik etkinliğin daha geniş bir bağlamda değerlendirilebileceğini göstermiştir. Ayrıca, hastalara ait transkriptom analizleri, yüksek PRMT1 ve PRMT6 ekspresyonunun zayıf kemoterapi yanıtıyla ilişkili olduğunu göstermiş ve lizozomal ekzositozun epigenetik kontrolünün klinik önemini desteklemiştir. Bu bulgulara tamamlayıcı olarak, tezin ikinci bölümünde epigenetik düzenleyicilerin, lizozom aracılı metal homeostazı ve ilaç direnciyle ilişkili genlerin transkripsiyonunu da düzenleyip düzenleyemeyeceği araştırılmıştır. Bu amaçla, ATP7B genine alel spesifik "firefly luciferase" ekspresyon kaseti eklenerek CRISPR/Cas9 ile düzenlenmiş bir "knock-in" model geliştirilmiş ve böylece endojen kromatin ortamını koruyan bir raporlayıcı hücre hattı elde edilmiştir. Aynı epigenetik ilaç kütüphanesinin bu rapor sisteminde taranması sonucunda, bazı histon deasetilaz (HDAC) inhibitörlerinin ATP7B transkripsiyonunu güçlü şekilde indüklediği belirlenmiştir. Bu etkiler, promotör-raporlayıcı analizleri, RT-qPCR ve kromatin immünopresipitasyonu ile doğrulanmış; HDAC inhibisyonunu takiben ATP7B promotöründe H3K9 ve H3K27 asetilasyonuna kıyasla özellikle H3K18 asetilasyonunun arttığı gösterilmiştir. Önemli olarak, bu transkripsiyonel aktivasyon hem hepatik hem de hepatik olmayan hücre türlerinde korunmuş ve reaktif oksijen türleri (ROS) birikiminden bağımsız gerçekleşmiştir. Bu çalışmalar birlikte ele alındığında, hem lizozomal ilaç dışa atımını hem de klinik açıdan önemli bir bakır taşıyıcısının ekspresyonunu kontrol eden kromatin düzeyindeki mekanizmaları ortaya koymaktadır. İlaç tutulumunu ve gen aktivasyonunu etkileyen epigenetik hedeflerin tanımlanması yoluyla, bu tez kanser ve metal birikim hastalıklarında terapötik stratejilerin geliştirilmesine yönelik kavramsal ve deneysel bir çerçeve sunmaktadır.