Termofilik Anoxybacillus flavithermus bakterisinin ısıl kararlı β-glukozidaz geninin klonlanması, ekspresyonu ve biyokimyasal karakterizasyonu

Dünyada bol bulunan ve yenilenebilir enerji kaynağı olan selülozun yıkımında da rol oynayan enzimlerden biri olan β-glukozidazlar (3.2.1.21), oligosakkaritlerin yapısında bulunan β-glukosidik bağların hidrolizinden sorumludur. Bu çalışmada, termofilik Anoxybacillus flavithermus bakterisine ait β-glukozidaz geni PZR ile saptanarak klonlanmış ve E.coli'de eksprese edilerek biyokimyasal karakterizasyonu amaçlanmıştır. Afbgl geni PZR ile yakalanarak Pet100 Directional TOPO Expression kit ile E.coli BL21Star (DE3) hücresinde eksprese edilmiştir. Sonrasında ısı çöktürmesi ve Ni+2 afinite kromatografisi yöntemleriyle saflaştırılmıştır. SDS-PAGE analizinde enzimin 53 kDa olduğu, optimum çalışma sıcaklığının 65ºC, optimum pH'sı 6,8 olarak bulunmuştur. Beta-glukosidaz enziminin substrat spesifikliği pNPG, pNPC, pNPX ve oNPG substratları kullanılarak belirlenmistir. Enzimin substratı olan p-nitrofenil β-glukozid ile yapılan kinetik denemelerde Vmax değerinin β-glukozidaz 5,13 x 105 µmol/dak/mg protein, Km değerinin ise 422,3 µM olduğu belirlenmiştir. Doğada sık karşılaşılan ağır metallerden K, Fe, Mn, Al, Mg, Zn ve Cu'nun saflaştırılmış β-glukosidaz enzim aktivitesi üzerine in vitro etkileri araştırılmıştır. Bu ağır metallerden Mg'un enzim aktivitesi üzerinde aktivasyon etkisi gösterdiği belirlenmistir. Ancak Cu, Zn, Al, Mn, Fe ve K ağır metallerinin ise enzim aktivitesi üzerinde inhibisyon etkisi gösterdiği tespit edilmistir. Anahtar Kelimeler: Anoxybacillus flavithermus, β-glukozidaz, termofilik enzim, pNPG, E.coli