Termofilik bir aktinomiset olan Thermobifida fusca EFTS 7A suşundan selülaz geninin klonlanmasi ve rekombinant proteininin üretilmesi

Bu tezde, İzmir Eski Foça'da bulunan, bir mantar çiftliği kompostundan elde edilen bir izolat kullanılmıştır. Bu izolatın, ekstraselüler selülaz ve ksilanaz üretim kapasiteleri, Kongo Red ve Gram İyodür gibi tarama metodları ile modifiye Thermoactinomyces besiyerinde belirlenmiştir. İzolatın tanılanması, 16S rRNA gen bölgesine göre yapılmış ve Gen Bankası'ndaki baz dizisi çakışmasına göre Thermobifida fusca EFTS 7A olarak adlandırılmıştır. Ekstraselüler selülaz, β-glukosidaz ve ksilanaz aktiviteleri spektrofotometrik yöntemle ölçülmüştür. Enzimlerin optimum aktivite gösterdiği koşullar, çeşitli pH ortamları, farklı karbon, organik ve inorganik azot kaynakları denenerek tespit edilmiştir. Optimum şartlar altında en yüksek selülaz aktivitesi avicel subsuratı varlığında 7.günde 230,6 U/L ve en yüksek ksilanaz aktivitesi ise ksilan subsuratı varlığında 7.günde 1350,6 U/L olarak ölçülmüştür. En yüksek β-glukosidaz aktivitesi, gliserol ve sellobiyoz içeren ortamda 6.günde 203,3 U/L olarak belirlenmiştir. Klonlanması düşünülen selülolitik gen bölgesi, genomu oluşturulmuş Thermobifida fusca YX aktinomiseti baz alınarak belirlenmiştir. Seçilen bölge, Tfu_0901 (cel5A) olup bir endoglukanazdır. Klonlama çalışmalarında kullanılacak kit içeriğine uygun primer çifti tasarlanmıştır. Bu gen bölgesi PZR aracılığıyla izole edilmiş ve jelden ekstraksiyonu yapılarak saflaştırılmıştır. Saflaştırılan bu PZR ürünü dizi analizine gönderilmiş ve diziler veritabanları ile karşılaştırılarak PZR ürününün ilgilenilen gen bölgesi olduğu belirlenmiştir. Klonlama için, gen bölgesi cel5A ve pKLAC2 vektörü restriksiyon enzimleri ile muamele edilmiş ve iki kesim ürünü tekrar saflaştırılıp ligasyon işlemi gerçekleştirilerek pKLAC2 vektörüne aktarımı tamamlanmıştır. Plazmit lineer ekspresyon kaseti oluşturmak için BstXI ile kesilmiş ve kompotent K.lactis GG79 hücrelerine lineer ekspresyon kaseti transforme edilmiştir. Petriler 5mM asetamid içeren YCB agar ortamında inkübe edilmiş ve zayıf koloni gelişimi gözlenmiştir. K.lactis GG799'a ait rekombinant selülaz aktivite ölçümleri DNS yöntemi ile 2.günde 50,4 U/L ve 3.günde 44,7 U/L olarak ölçülmüştür. Anahtar Kelimeler: Termofilik aktinomiset, selülaz, primer, PZR, restriksiyon enzimi, klonlama