Theileria annulata'nın enolaz enzimini kodlayan genin intronsuz olarak klonlanması, enzimin ifade edilmesi, saflaştırılması ve kinetik karakterizasyonu

Tropikal theilorisis, Hyalomma cinsi kenelerce taşınan apikompleksan paraziti Theileria annulata aracılığıyla yüksek verimli sığırlarda enfeksiyona ve yüksek oranda morbidite ve mortaliteye neden olmaktadır. Bu nedenle tropikal theilorisis büyük ekonomik kayıplara neden olan yaygın ve önemli bir hastalıktır. Son yıllarda parazitin hastalığın tedavisinde kullanılan en etkin ilaca karşı direnç geliştirdiği bildirilmiştir. Bu durum, alternatif tedavi yöntemlerine ihtiyaç doğurmuştur. Glikolizis, Theileria annulata'nın ATP eldesinde, canlılığı ve virülansında çok önemli bir rol oynamaktadır. Bu nedenle bu yolak, antitheilerial ilaçlar için aday olan hedeflerdendir. Enolaz 2-fosfogliserikasidin (2-PGA) ve fosfoenolpirüvatın (PEP) tersinir dönüşümünü katalizleyen kilit bir glikolitik enzimdir. Ayrıca, son yayınlar ile enolazın, bazı patojenik organizmaların hücre yüzeyinde ifade edildiği belirtilmiştir. Hücre yüzeyindeki enolaz, plazminojen bağlanma reseptörü olarak görev almakta ve dokuya invazyonda önemli bir rol oynamaktadır. Enolaz, Theileria annulata için kilit bir glikolitik enzim ve plazminojen bağlanma reseptörü olması olmasından dolayı, tropikal theilorisis tedavisinde makromoleküler bir hedef olarak seçilebilir. Bu çalışmada Theileria annulata'nın enolaz enzimini kodlayan gendeki intron dizisi PCR temelli yönlendirilmiş mutagenez ile uzakkalştırılmış ve bu gen pGEM-T Easy vektörüne klonlanmıştır. İntronun uzaklaştırılması DNA dizi analizi ile onaylanmıştır. Bu gen daha sonra C-terminalinde 6 Histag kuyruğu içeren pLATE31 vektörüne altklonlamış ve Escherichia coli BL21(DE3) hücrelerinde ifade edilmiştir. İfade edilen enzim Ni-NTA agaroz kolon kullanılarak afinite kromatografisi aracılığıyla saflaştırılmıştır. Enzime ait kararlı hal kinetik verileri GraFit 3.0 ile tanımlanmıştır. Theileria annulata'ya ait RNA örneğinin yokluğundan dolayı, yapıya dayandırılmış ilaç tasarımı çalışmalarına uygun olacak aktif enzimin üretilmesi için, gendeki intron dizisinin uzaklaştırılmasında PCR temelli yönlendirilmiş mutagenez kullanılarak bir strateji geliştirilmiştir. Bilgimiz dahilinde, bu çalışma orjinal intron dizisini içeren genden aktif enzimin üretilmesi amacıyla ilk kez uygulanmıştır. Aktif enzimin ifadesi ve saflaştırılması yeni ilaç tasarım çalışmaları ve hastalığın yok edilme stratejileri için önemlidir. İntron uzaklaştırılmasını takiben saf rekombinant Theileria annulata enolazının yüksek miktarda eldesi (30 mg/litre kültür) yüksek saflık derecesinde (>% 95) sağlanmıştır. Saflaştırılan proteinin molekül ağırlığı SDS-PAGE'te amino asit sekansından hesaplanan kütle doğrulaması ile yaklaşık olarak 48 kDa büyüklüğünde tek bant vermiştir. 2-PGA'nın substrat olarak kullanıldığı enzim aktivite ölçümleri, spesifik aktivite değerini 43 U/mg, Km=106 µM, Vmax=0,132, kcat=37 s-1 ve kcat/Km=3,5x105 M-1.s-1 olarak vermiştir. Bu değerler bu parazit için ilk defa tanımlanmıştır ve enolaz enziminin büyük miktarlarda eldesi yeni antitheilerial ilaçların tasarımına yönelik daha ileri kinetik ve yapısal karakterizasyon çalışmalarına olanak sağlayacaktır.