Turboid ile NEK2a'nin yari-dinamik hücre döngüsü etkileşimlerinin bulunmasi ve Nusap1'in yeni bir partner olarak incelenmesi

Nek2A, hücre döngüsünde düzenlenen bir kinazdır ve birçok hücresel süreçte yer alırken birçok kanser türünde aşırı üretildiği gözlenmiştir. Nek2'nin kanser üzerindeki rolünü derinlemesine anlamamıza yardımcı olacak olan çalışmamızın başlıca amacı, hücre döngüsü sırasında Nek2A ile etkileşime giren özel partnerleri belirlemektir. Bu amaca ulaşmak için TurboID biyotinleme tekniğini senkronize hücre grupları üzerinde kullanarak, hücre döngüsünün ilerledikçe Nek2A'nın dinamik etkileşimlerini inceledik. Hücrele döngüsünü çift timidin blok yöntemini kullanarak durdurduk ve G1/S, geç S ve G2/M hücre döngüsü evrelerine odaklanarak belirli aralıklarla topladık. Kütle spektrometrisi kullanarak biotinilenmiş proteinleri tanımladık ve bunları MaxQuant, Cassiopeia ve Amica araçlarıyla analiz ettik. Deneylerimiz, daha önce tanınmış Nek2A partnerleri olan Anafazı Teşvik Edici Kompleks (APC) ve Kif24 gibi proteinleri güvenilir bir şekilde tanımladı. Nek2A'nın G1/S, geç S ve G2/M evrelerinde yakından etkileşimde bulunduğu proteinleri western blotlama kullanarak doğruladık. Ko-immünopresipitasyon, Nek2A'nın Nusap1, Kif2c, Mapre3 ve Mpg gibi proteinlerle doğrudan etkileşimlerini ortaya çıkardı. Bu proteinlerin Nek2A ile ko-lokalizasyonunu floresan mikroskopi kullanarak doğruladık. Nek2A partnerlerinden farklı bir rol üstlenen Nusap1'e özel bir ilgi gösterdik. Nusap1, DNA hasarı proteinlerinin stabilizatörü olarak çalışır ve onun azalması DNA iplikçik kırıklarına yol açarak hücrenin hayatta kalmasını olumsuz etkileyebilir. Analizlerimiz, hücre döngüsünün ilerlemesi sırasında ubikitinleme tarafından yönlendirilen proteolizin yaygın bir şekilde meydana geldiğini gösterdi. İlk olarak, Nek2A aktivitesi azalmış veya artmış hücrelerde Nusap1'in protein miktarını inceledik. İlginç bir şekilde, siRNA tedavisi sonrasında ve iki farklı Nek2 null (KO) hücre varyantında Nusap1 seviyelerinde artış gözledik. Nek2A'nın aşırı ifadesi ise, diğer hücre mekanizmalarının muhtemelen dengelenmesi öncesinde yalnızca 6 saat süren Nusap1 miktarında bir kısa süreli azalmaya neden oldu. Bu azalmayı MG132 adlı iyi bilinen proteazom inhibitörü kullanarak tersine çevirebildik. Ayrıca, Nek2A KO hücrelerinde Nusap1'in ubikitinasyonunda dikkate değer bir azalma gözlemledik. Bu durumun proteazomal bozulma süreçlerinin rolünü işaret ettiğini hipotezledik. Ayrıca, Nek2A knock out hücrelerde Nusap1 dahil birçok proteini içeren geniş bir protein analizi, azalan ifadelerini doğruladı. Özetle, bulgularımız Nusap1'i yeni bir Nek2A partneri olarak işaret etti ve Nek2A'nın olası olarak Nusap1'in ubikitinasyon yoluyla parçalanmasını etkileyebileceğini düşündürdü. Bu etkileşimin tam doğası ve klinik önemi daha fazla araştırmalar yapılarak aydınlatılacaktır.