Sisplatin ile indüklenen insan granüloza hücrelerinde ki hücre hasarini önlemek için CRİSPR/DCAS9 tasarlanmiş MSC'lerin kullanimi

Kemoterapiye bağlı yumurtalık hasarı, kadınlarda kemoterapi alan kadınlarda yumurtalıkların işlevini geçici veya kalıcı olarak yitirebildiği bir durumdur ve yumurtalık disfonksiyonunda düşük östrojen serum seviyesi, amenore ve infertilite gibi belirtiler görülebilir . Cisplatin, tüm yumurtalık hücreleri üzerinde gonadotoksik etkisi olan platin bazlı bir antikanser kemoterapötik ilaçtır. Kök hücreler, özellikle yetişkin bir kök hücre olan mezenkimal kök hücreler kemoterapiye bağlı yumurtalık hasarı için yardımcı bir tedavi olarak denenmektedir. CRISPR genom düzenleme teknolojisi, en yaygın olarak kullanılan gen düzenleme sistemidir ve nükleaz etkisinden yoksun dCas9 (ölü Cas9), bir CRISPR aktivasyon aracıdır. Bir sinerjistik aktivasyon aracısı (SAM), iki MS2 aptameri dahil olmak üzere modifiye edilmiş bir sgRNA ile entegre edilmiş dCas9-VP64 füzyon proteininden oluşan bir CRISPR/dCas9 aktivasyon sistemidir. MS2 bağlayıcı proteini, diğer iki aktivatör alanı olan p65 ve HSF1 ile birleştirilir ve bu füzyon proteini (MS2-p65-HSF1), MS2 aptamerleri ile etkileşime girer. Bu şekilde daha yüksek bir gen aktivasyonu sağlanmış olur. Eksozomlar, 20-200 nm arasında değişen ve biyolojik sıvılardan izole edilebilen hücre dışı veziküllerdir. Eksozomlar mRNA, uzun kodlamayan RNA, mikroRNA'lar, proteinler ve lipitler içerirler. Eksozomlar, hücreler arası iletişimde, hücrelerin gen ve protein ekspresyon sinyallerini iletmede önemli bir rol oynarlar. Bu çalışmanın amacı, dCas9 ile genomu düzenlenmiş MSC'leri sisplatine reve eksozomlarını üreterek ve bu hücrelerin daha dirençli veya kemoterapötik, sisplatin olup olmadığını test etmektir. Bu çalışmanın amacı CRISPR/ dCas9 genom düzenleme aracı ile MSC hücrelerini sisplatine karşı dirençli hale getirmek ve ardından bu hücreleri ve bu hücrelerden elde edilmiş eksozomları kemoterapiye bağlı yumurtalık hasarını korumaya yönelik kullanmaktır.SAM aktivatör sistemi kullanılırak CD99 geni aktive edildi sisplatine karişı dirençli mezenkimal kök hücreler elde edildi. Ardından normal ve dirençli mezenkimal kök hücrelerden ayrı ayrı eksozomlar izole edildi. Daha sonra bu hücrelerden sferoidler elde edildi. "Transwell" kültür tabaklarının alt kısmında deneysel tedavi grupları ve üst kısmında(insert) hGRC1 (insan granuloza hücre dizisi) hücreleri kullanılarak ko-kültürler oluşturuldu. Ko-kültürler oluşturulduktan sonra hücreler sisplatine maruz bırakıldı. hGRC1 hücreleri sırasıyla 24, 48, 72 ve 96 saat sonra toplandı. İlk olarak, toplanan hücreler de canlılık testi yapıldı. Daha sonra qPCR ile inflamasyon ve apoptoz belirteçleri olan IL-10, IL-1Ra, Bax ve Bcl-2 genlerinin ifadeleri analiz edildi. Sonuç olarak, tüm deney gruplarında kontrol grubuna göre daha fazla canlı hücre olduğu, her saat grubunda inflamatuar ve apoptoz değerlerinin düştüğü gözlemlendi. Ayrıca dirençli hücrelerin, dirençli olmayan hücrelere göre daha etkili bir koruma sağladığı görüldü. Diğer deney gruplarına göre önemli ölçüde daha fazla koruma sağlayan grup, dirençli mezenkimal kök hücreleri ve bu hücrelerden izole edilen eksozomların birlikte kullanıldığı grup olmuştur. Bu sonuçlar sisplatin gibi kemoterapötiklerle dirençli hale getirilmiş mezenkimal kök hücrelerin ve onların eksozomlarının kullanımının granuloza hücrelerini koruyabileceğini göstermesi açısından önemlidir. Anahtar Kelimeler: Mezenkimal Kök Hücreler, İnfertilite ,CRISPR/dCas9, Eksozomlar, Kanser