Visseral leishmaniasis etmeni Leishmania infantum antijenine karşı hibridoma tekniği ile monoklonal antikor elde edilmesi

Leishmaniasis, enfekte kum sineklerinin (Phlebotomus) kan emme esnasında memeli konaklara bulaştırdıkları hücre içi Leishmania protozoonlarının oluşturduğu bir hastalık grubudur. Hastalığın Visseral (VL), Kütanöz (KL) ve Mukokütanöz (MKL) olmak üzere 3 klinik formu mevcuttur. Dünyada her yıl 1,0-1,5 milyon kişi KL'e, 500.000 kişi ise VL'e yakalanmaktadır. Ayrıca son yıllarda hastalığın etkenlerinde kullanılan antileishmanial ilaçlara, vektörlerinde ise insektisitlere karşı dirençliliğin gelişmesi ve küresel ısınmanın dünya üzerindeki etkisini arttırması nedeniyle hastalığın dünyada giderek yayılması beklenmektedir. Leishmaniasis aynı zamanda Türkiye'nin de ciddi halk sağlığı problemlerinden biri olup Ege, Akdeniz, Orta Anadolu ve Güneydoğu Anadolu bölgelerinde görülmektedir. Hastalığın visseral formu tedavi edilmediğinde ölüme neden olmaktadır. Hastalığın tanısında çeşitli yöntemler (mikroskobik, kültür, moleküler ve serolojik) kullanılmaktadır. Bu yöntemler içerisinde parazite özel antijenleri hedefleyen monoklonal antikorların temel alındığı serolojik teknikler, yüksek duyarlılıkları ve spesifiklikleri ile leishmaniasis tanısının koyulabilmesi adına büyük bir avantaj sağlamaktadır. Ancak leishmaniasis'in tanısında kullanılmak üzere geliştirilen serolojik tanı kitleri genellikle yurt dışından ithal edilmekte ve bu da ülke ekonomisine fazladan bir külfet oluşturmaktadır. Ülkemizde ise konu ile ilgili yeterince çalışma bulunmamaktadır. Şu ana kadar yapılan tek çalışmada KL'e (Leishmania tropica) karşı monoklonal antikor geliştirme çalışması yapılmıştır. Ancak literatürden de bilindiği gibi KL için serolojik yöntemlerin duyarlılığı yüksek değildir. Diğer yandan ülkemizde, erken teşhisine daha çok ihtiyaç duyulan ve zamanında tanısı konulup tedavi edilmediğinde ölümcül olduğu bilinen VL'e karşı monoklonal antikor geliştirilmesine yönelik ülkemizde yapılan hiçbir çalışma bulunmamaktadır. Ayrıca hibridoma teknolojisinde kullanılan sürecin tamamen in vitro hale getirilmesinde sorunların yaşandığı da bilinmektedir. Buna göre de bu tez çalışmasının amacı; ilk kez olarak ülkemizde VL'nin tanısında kullanılan L. infantum antijenlerine karşı monoklonal antikorun üretilmesi ve L. infantum antijenlerine karşı monoklonal antikorun üretilmesi için hibridoma teknolojisinde kullanılan sürecin in vitro hale getirilmesi ile mevcut yöntemin optimize edilmesi olmuştur. Tez çalışması kapsamında, Hücre Kültürü ve Doku Mühendisliği Laboratuvarı'nda hücre kültürü, ELISA, western blot, hibridoma, saflaştırma tekniklerine dayalı çeşitli yöntemler kullanıldı. Deneylerde L. infantum tüm parazit antijenleri 6-8 haftalık BALB/c farelere Freund adjuvanı ile birlikte enjekte edildi. Yüksek antikor yanıtı veren fareler ile füzyon çalışmaları gerçekleştirildi. Füzyon deneylerinde immünize farelerden izole edilen ve B lenfosit kaynağı olan dalak hücreleri, fare myeloma hücreleri (P3-X63-Ag8.653) ile polietilen glikol (MW 4000) varlığında birleştirildi. Füzyon sonrası hibridoma hücrelerinin gelişimini desteklemek amacıyla fare periton makrofajlarının yanı sıra, J774 fare monosit makrofaj hücre hattı metaboliti de kullanıldı. Deney sonuçlarına göre, incelenen 456 kuyunun 233'unda hibridoma hücrelerinin oluştuğu tespit edildi. ELISA testi ile incelenen 233 kuyunun 46'sında pozitiflik görüldü. Çapraz reaksiyon testlerinde en yüksek absorbans alınan 3 kuyunun kültürü büyük çapta üretildi. Sınırlayıcı sulandırımlar sonucu elde edilen 1C3 kuyusundaki hibridoma hücre hattının ürettiği monoklonal antikorlar western blot yöntemi ile 15kDa ağırlığında olan L. infantum antijenine karşı spesifik olduğu saptandı. Çalışmanın son aşamasında elde edilen süpernatant dializ ve protein G afinite kromatografi yöntemleri ile saflaştırıldı ve böylece L. infantumun 15 kDa antijenine karşı spesifik olan monoklonal antikor elde edildi.Sonuç olarak bu çalışmada, ilk kez olarak ülkemizde L. infantum'a karşı monoklonal antikor üreten hücre hattı elde edildi ve kriyoprezervasyonu gerçekleştirilerek kriyobankı oluşturuldu. Ayrıca leishmaniasise karşı hibridoma teknolojisinde kullanılan sürecin in vitro hale getirilmesi için ilk kez olarak fare periton makrofajları yerine J774 metabolitlerinin kullanılmasının uygun olabileceği gösterildi ve hibridoma teknolojisinde kullanılan sürecin tamamen in vitro hale getirilmesi amacıyla mevcut yöntem optimize edildi. Bu tez kapsamında elde edilen sonuçlar, ülkemizin ciddi halk sağlığı problemlerinden birisi olan VL'nin tanısında monoklonal antikorlara dayalı yerli tanı kitlerinin geliştirilmesine yol açacaktır. Ayrıca bu hastalığa karşı üretilen monoklonal antikorların ileride farklı enzimatik, kemilüminesan ve manyetik ajanlarla konjuge edilmesi sonucunda çeşitli tanı sistemlerinde (Western Blot (WB), Enzim bağlı immunosorbent test (ELISA), İndirekt floresan Antikor testi (IFAT),İmmünokromatografik test (ICT) gibi) kullanılabileceğini göstermesi açısından oldukça önemli olacağı düşünülmektedir.