Yem değerini artırıcı enzim genlerinin probiyotik etkili laktik asit bakterilerinde klonlanarak üretimi

Fitazlar, bitkilerdeki fosforun ana depo formu olan fitatdan inorganik fosfatın serbest kalmasını sağlayarak gıda ve yemlerin besleyici değerini artıran enzimlerdir. Bu çalışmada, Bacillus subtilis VTT E-68013'den fitaz geni (phyC) PCR tekniği ile çoğaltılmış ve pMK3F'yi oluşturmak için Escherichia coli-Bacillus sp. mekik vektörü pMK3'e yerleştirilmiştir. pMK3F rekombinant vektörü ilk önce sıcaklık şoku yöntemi ile E. coli'ye aktarılmıştır. E. coli'den izole edilen pMK3F plazmidi kullanılarak elektrotransformasyon yöntemi ile Bacillus coagulans'a aktarılmıştır. E. coli ve B. coagulans'dan elde edilen bu rekombinant plazmidlerin HindIII ve BamHI enzimleri ile kesilmesi sonucu agaroz jel'de, phyC'yi kodlayan 1300 bç büyüklüğündeki DNA fragmenti ile 7200 bç büyüklüğündeki pMK3 vektörü gözlenmiştir. pMK3F rekombinant vektörünün fitaz geni PCR ile çoğaltılmış ve agaroz jelde gözlenerek sonuçlar desteklenmiştir. Fitaz geni, B. coagulans'da klonlanmasına rağmen Buğday Kepeği Ekstraktı/Sodyum-fitat/LB/Agar besi yerinde ve Buğday Kepeği Ekstraktı/Na-fitat substratları içeren SDS-PAGE'de fitaz aktivitesi tespit edilememiştir. ß-(1,3-1,4)-glukanazlar (likenazlar), ß-glukanlar ve likenanlar gibi ß-1,3 ve ß-1,4 bağları içeren düz ß-glukanları hidrolize eden enzimlerdir. Streptococcus bovis kökenli likenaz geni pMK3Lik plazmidini oluşturmak için E. coli-Bacillus sp. mekik vektörü pMK3'e yerleştirilmiştir. pMK3Lik rekombinant vektörü ilk önce E. coli'ye daha sonra da B. coagulans'a aktarılmıştır. E. coli ve B. coagulans'dan elde edilen bu rekombinant plazmidlerin SmaI enzimiyle kesilmesi sonucu agaroz jel'de 1800 bç'lik likenaz genine ait bant gözlenmiştir. pMK3Lik plazmidini taşıyan E. coli hücrelerinde hem LB/Likenan/Agar besi yerinde hem de SDS-Likenan-PAGE'de likenaz aktivitesi gözlenirken rekombinant B. coagulans'da enzim aktivitesi tespit edilememiştir. Anahtar kelimeler: Fitaz, likenaz, Bacillus coagulans, probiotik, klonlama