Yenilikçi bir SMAD bildirici yaklaşımı geliştirilmesi

Dönüştürücü Büyüme Faktörü-β (Transforming growth factor-𝛽/ TGF-β) yara iyileşmesi başta olmak üzere hücre farklılaşması, apoptozis, immün cevabın düzenlenmesi gibi birçok fizyolojik süreçte düzenleyici role sahip olan bir sinyal molekülüdür. İnaktif yapıda sentezlenen TGF-β, yapısında bulunan Gizli TGF-β Bağlayıcı Protein (Latent TGF-β Binding Protein / LTBP) aracılığıyla hücre dışı matriks (Extracellular matrix / ECM) proteinleriyle kovalent bağlar kurarak ECM'de inaktif bir şekilde tutulur. TGF-β çeşitli uyaranlar tarafından uyarılıp aktifleştikten sonra hücre yüzeyinde bulunan reseptör kompleksine bağlanarak sinyal yolağını uyarır. Aktifleşme sürecinin kontrolsüz bir şekilde süreklilik kazanması, ECM elemanlarının geri dönüşümsüz bir şekilde birikmesiyle sonuçlanan "fibrozis" ile ilişkilidir. Ayrıca bu yolak kanser, otoimmün hastalıklar ve ateroskleroz patolojisinde de rol almaktadır. Bu nedenle TGF-β sinyal yolağının, özellikle de molekülün hücrede transkripsiyonu düzenleyen bir yanıtı tetikleyip tetiklemediğinin takip edilebilmesi bu yolağı hedefleyen yeni tedavi yöntemlerinin geliştirilebilmesi için önemlidir. Bu tez çalışması kapsamında, TGF-β sinyalinin in vitro takibini sağlamak için Salgılanan Alkalen Fosfataz (Secreted Alkaline Phosphatase / SEAP) ve Yeşil Floresan Protein'lerinden (Green Fluorescent Protein /GFP) oluşan bildirici nitelikte bir füzyon proteini geliştirilmiştir. TGF-β etkisi ile bu yapının ifadesini sağlamak amacıyla TGF-β'ya özgü transkripsiyon cevabını oluşturan SMAD (Suppressor of Mothers Against Decapentaplegic) proteinlerinin bağlanma dizisi kullanılmış, yenilikçi bir dual bildirici vektör sistemi geliştirilmesi planlanmıştır. Yapılan çalışmalar sonucunda geliştirilen bildirici vektörün aktarıldığı hücrelerde TGF-β uygulanmayan kontrol grubuna kıyasla TGF-β uygulanan grupta akış sitometri analizi ile artan GFP sinyali gösterilmiştir. Bunun yanı sıra GFP sinyalinin TGF-β konsantrasyonuna bağıntılı ölçüde artışı gözlenmiştir. Çalışma sonucunda, elde edilen bildirici vektör yapısının beklenen işlevsel SEAP aktivitesini sergilemediği gözlemlenmiştir. Bu doğrultuda SEAP işlevselliği için optimizasyon çalışmalarının yapılmasına ihtiyaç vardır.