16
Arşivlenen Tez
0
DOI Atanmış
0%
DOI Oranı
Anabilim Dalı
Mikroakışkan yonga üzerinde karaciğer kanser hücrelerinde anti-kanser ilaç değerlendirilmesi
Başlık: Mikroakışkan yonga üzerinde karaciğer kanser hücrelerinde anti-kanser ilaç değerlendirilmesi. Amaç: Son yıllarda mikroakışkanlara dayalı çip üzerinde kanser modelleri, tümör mikro ortamını ve bunun metastazdaki rolünü araştırmak ve kanser ilaçlarının etkinliğini hızlı bir şekilde değerlendirmek için, etkili araçlar olmuştur. Bu tez çalışmasında çip platformu üzerinde karaciğer kanseri modeli oluşturularak antikanser etkisi ve bilinen etken maddelerin etkisinin araştırılması amaçlanmıştır. Yöntem: 3-(4,5-dimetiltiyazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolyum bromür (MTT) sitotoksisite testi ile kurkumin, Siklofosfamidin (CYP) kombinasyonunun hücreler üzerindeki sitotoksik etkisi araştırılmıştır. Ardından apoptotik ve toksik etki; statik ve dinamik kültür ortamında canlı/ölü boyama, immunofloresan boyama (kaspaz-3, kaspaz-8, AFP, CK18) ile araştırılmıştır. Bulgular: MTT analizine göre 24 saat sonunda IC50 değeri kurkumin için 80µM, CYP 3mM belirlenmiş ve her iki etken maddenin kombinatif etkisinin (60 µM/1,5mM) belirlemek için karakterizasyon araştırmaları yapılmıştır. Buna göre, IF yöntemi ile AFP, CK18, aktiv kazpaz 3,kaspaz 8 biyobelirteçlerin ifadesinin değiştiği görülmüştür. Canlı/ölü boyama sonuçlarına göre etken dozla birlikte hücre canlılığının azaldığı, kurkumin ve CYP kombinasyonu ile birlikte ise hücre sayısında önemli ölçüde azalma olduğu halde, mikroakışkan kültür ortamında statik kültür ortamına nazaran hücre canlılığının arttığı gözlemlenmiştir. Sonuç: Karaciğer kanser mikrofizyolojisinin taklit edildiği çip platformu modelinde kurkumin, CYP ve kurkuminin kombinasyonunun anti-kanser aktivite gösterdiği ortaya konulmuştur. Sonuç olarak, elde edilen verilerle çip üzerinde karaciğer kanserinin, in vivo modellere daha yakın olan anti-kanser ilaç aktivitelerini test etmek için yeni nesil olarak geliştirilen karaciğer kanser çip platformunun kanser araştırmaları için uygun bir model olabileceği düşünülmektedir. Anahtar Kelimeler: Çip üzerinde karaciğer kanseri, Siklofosfamid, kurkumin, apoptozis, karaciğer kanseri.
Wharton jeli kökenli mezenkimal kök kücrelerin (iWJ-MKH'lerin) ımmünomodulatuvar özellikleri
Amaç: Bu tez çalışmasının amacı, hem potensi hem de allojenik kullanımları ile ön plana çıkmış olan iWJ-MKH'lerin immunosupresif etkinliğini artırmak için immünregülasyonda görev alan matür miRNA-181a'yı transfekte etmek ve transfeksiyonun etkisini, in vitro bağışıklık sistemi modeli olan insan pan T hücre modelinde analiz etmektir. Yöntem: Bu tez çalışmasında miRNA transfekte iWJ-MKH'lerle ko-kültür sonrası T hücre yanıtı; canlılık ve proliferasyon (CCK8), apoptosis (AnnexinV-PI yöntemi) ve hücre siklusu değişimi (flow sitometrik hücre siklusu analizi), anti- ve pro-inflamatuar sitokinler (TGF-beta1, IL-6, TLR-4 ve STAT1), regülatuar T-hücre (Treg) (CD4+CD25+Foxp3+), T-bet ve T hücre belirteç/gen ekspresyonları (CD3,CD4, CD45, CD4+CD8 ve CD69) üzerindeki etkisi analiz edildi. Bulgular: PHA-M ile aktive edilmiş T lenfositlerinde faz konstrat mikroskopu ile belirgin ve canlılık oranı yüksek koloni oluşturma yetenekleri gösterildi. Hem miRNA transfekte edilmiş hem de edilmemiş iWJ-MKH'lerin 4. günde apoptotik etki göstermediği üstelik apoptozun azaldığı tespit edildi. Hücre siklusu analizinde 4. günde yalnız T hücreleri ile karşılaştırdığımızda MKH'ler ile ko-kültür edilen T hücrelerinde proliferasyon ve apoptozun azaldığı ve miRNA transfekte MKH'ler ile ko-kültür edilenlerde ise proliferasyonun azaldığı ve apoptozun arttığı (*p<0.05) belirlendi. Her iki ko-kültür grubunda da T hücre belirteçlerini eksprese eden T hücre %'sinin azaldığı belirlendi. TGF-beta gen ekspresyonu azalmışken kokültür besiyerindeki hem MKH hem Treg'den sekreyonunun arttığı ve Tbet hücre populasyonunun artmasına rağmen salgısı olan IFN-gama sekreyonunun ise azaldığı belirlendi. MKH'lerde miRNA transfeksiyonunun, T hücre proliferasyon, apoptoz ve Treg ve T-bet populasyonunu arttırdığı gözlemlendi. Sonuç: miR-181a transfeksiyonunun MKH'lerin immunsupresif etkilerini IL-6, STAT-1 ve DUSP5 genleri ve TGF-beta ve IFN-gama sitokinleri yoluyla düzenlediği sonucuna varıldı. Bu proje TUSEB A2 31858 nolu projesi ile desteklenmiştir.
Çip üzerinde karaciğer kanseri platformunda ilaca bağlı karaciğer endotel hasarının incelenmesi
Amaç: Günümüzde hastalıklı dokuların morfolojik ve fonksiyonel rekonstrüksiyonu için mikroakışkanlardaki son gelişmelerle birlikte, tasarlanmış in vitro sistemlere damar hücreleriyle birlikte vasküler bileşenler dahil edilmiştir. Bu sayede hemodinamiğin ve ilaçların/çözünür faktörlerin mikroakışkan perfüzyon kanalı yoluyla hepatosellüler kanser (HCC) ile birlikte sağlıklı ve hastalıklı 3B karaciğer mikroçevresinin gerçeğe daha yakın modellenmesine olanak tanımaktadır (Lauschke, 2019). Kemoterapötik ilaçlar karaciğer kanseri üzerinde etkili olmasına rağmen kanser hücrelerine karşı seçici değildir ve sağlıklı hücrelere de etki ederek toksisiteye neden olabilmektedir. Çalışmamızda, 3B karaciğer kanser modeli oluşturularak karaciğer kanserinde kullanılan bir kemoterapi ilacının (Siklofosfamid) endotel hücrelerine etkisinin incelenmesi amaçlanmıştır. Yöntem: Endotel hücrelerinin monolayer statik kültürde ve çip üzerinde karaciğer kanser platformu içerisinde 24 ve 96 saat siklofosfamide maruz bıraktıktan sonra ilacın toksik etkisini belirlemek için canlı/ölü boyama ile canlılık analizi, flow sitometri analizi ile hasar belirteci doku faktörünün (CD142) ekspresyonu, ilaç uygulaması sonrasında hücrelerin canlılık ve proliferasyonu (MTT yöntemi ile) ve endotel hücre yüzey belirtecinin (CD31/PECAM1), immunofloresan işaretlemesi yapılarak morfolojik değişiklikleri incelenmiştir. Bulgular: Siklofosfamid'in hem monolayer statik kültür ve 3B dinamik kültürü yapılan endotel hücrelerinin canlılık oranını düşürdüğü gözlemlendi. İkili kültürü yapılan deney gruplarının ilacın etkisine karşı daha dayanıklı olduğu İF işaretleme ve canlı/ölü boyama analizleri ile görüldü. Sonuç: Tez çalışmasında özellikle CD31 ve CD142 belirteçlerinin Siklofosfamid'in endotel hücreleri üzerinde olan hasarı belirlemede yardımcı olabileceği sonucuna ulaşılmıştır.
Üç boyutlu biyobaskılama yöntemiyle akciğer kanser kök hücreleri kullanılarak In-Vitro ko-kültür sisteminde akciğer üç boyutlu tümör mikro-çevresinin oluşturulması
Amaç: Doku mühendisliği ve rejeneratif tıpta en çok kullanılan yöntemlerden biri olan 3 boyutlu (3B) biyobaskı teknolojisi, kök hücre çalışmaları ve ilaç araştırmalarının da içerisinde olduğu birçok fizyolojik mekanizmanın aydınlatılmasında kullanılan önemli bir tekniktir. Bu teknolojideki ilerlemelere rağmen tam anlamıyla küçük hücreli dışı akciğer (AC) kanseri (A549) modelleri gerçek AC tümör dokusunu taklit etmekte yetersiz kalmaktadır. Bu çalışmada in vivo tümör mikroçevresini morfolojik ve fonksiyonel bir 3B organoid tipte biyobaskı yöntemiyle oluşturabilmek için; AC kanser kök hücreleri, insan endotel hücreleri (EA.hy926) ve sağlıklı AC epitel hücrelerinin (BEAS-2B); tümör mikromimarisi ve hava-sıvı arayüzeyine uygun olarak 3B biyobaskılanması ve karakterizasyonu amaçlandı. Yöntem: EA.hy926 hücreleri in-vivo mikromimari düzenine uygun olarak transwell membrana ekilerek kaplandı. BEAS-2B ve KKH hücreleri özelliklerine uygun olarak geliştirdiğimiz iki tip biyomürekkep kullanılarak 3B biyobaskılanarak hava-sıvı arayüzeyinde kültür edildi. Elde edilen AC 3B tümör mikroçevresi organoidinde canlı/ölü, SEM, histokimya ve immunofluoresan analizleri ile karakterize edildi. Bulgular: Hem biyomürekkep 1'in (BEAS-2B hücreleri) hem de biyomürekkep 2'nin (BEAS-2B ve AKKH) hücre canlılığı, por çapı ve hücre boyutları açıcından in vivodaki mikromimarisine ve hücreye spesifik olan belirteçlerine uyumlu olduğu görüldü. Sonuç: Geliştirilen bu biyomürekkepler, biyobaskılama tasarımı ve hava-sıvı arayüzeyi modellerinin; ileride tümör mikroçevresinde bulunan diğer hücrelerin de eklendiği ve uzun süreli kültüre olanak tanıyan biyoreaktörler kullanılarak kurgulanan çalışmalara ihtiyaç duyulduğu düşünülmektedir.
Allojeneik hematopoietik kök hücre nakli yapılan hastalarda akut graft versus host hastalığı ve kronik graft versus host hastalığı'nın retrospektif değerlendirilmesi
Enfeksiyon proflaksisinde, immünsüpresif stratejilerde, DNA bazlı doku tiplendirmesinde ve destekleyici bakım önlemlerinde kaydedilen gelişmelerle birlikte allojeneik hematopoietik kök hücre nakli (Allo-HKHN) ile önemli oranda hastalık kontrolü ve kür sağlama başarısı sağlanmıştır. Graft Versus Host Hastalığı (GVHH) da Allo-HKHN sonrasında görülen en ciddi morbidite ve mortalite nedeni olan komplikasyonlardan biridir. Bu gözlemsel çalışmanın amacı; Allo-HKHN yapılan hastalarda nakil sonrası GVHH'nin görülme sıklığı, akut GVHH (aGVHH) ve kronik GVHH (krGVHH) gelişiminde ki risk faktörlerinin belirlenmesi, proflakside kullanılan ilaçların GVHH gelişimi üzerine etkisi, GVHH'nin mortalite ve morbidite üzerine etkisini araştırmaktır. Çalışmada Adnan Menderes Üniversite Hastanesi ve Özel Kent Hastanesi Erişkin Kemik İliği Nakil Merkezlerinden Ocak 2013 ile Mayıs 2019 tarihleri arasında Allo-HKHN yapılan ve yeterli dosya verilerine ulaşılan 162 hasta GVHH açısından geriye dönük olarak değerlendirildi. Hastaların tıbbi değerlendirme ve izlem amaçlı yapılmış olan laboratuvar incelemeleri, patoloji ve epikriz raporları hastane otomasyon sisteminden ve hastanede kayıtlı dosyalarından elde edildi. Çoğunluğunu akut lösemilerin oluşturduğu Allo-HKHN yapılan hastaların %54,3'ünde nakil sonrasında GVHH tanısı saptandı. GVHH tipinin ve derecesinin sağkalım sürelerini etkilediği görüldü. Sağkalım süreleri açısından GVHH tipinden en çok etkilen tanı AML idi. CMV-Reaktivasyonunun pozitifliği ile GVHH tipi arasında da anlamlı bir ilişki bulundu. GVHH'den en sık etkilen organ deri olarak saptandı. Enfeksiyon en sık ölüm nedeni olarak saptanırken, GVHH'den ölen hastaları oranı %3,06 idi. Bu çalışma sonucunda GVHH tipi ve derecesi ile CMV-Reaktivasyonunun sağkalımı çok önemli oranda düşürdüğü gösterilmiştir. Ayrıca aGVHH derecesinin de özellikle AML tanılı hastaların sağkalımını ciddi oranda düşürdüğü gösterilmiştir.
Fankoni anemisi kemik iliği mezankimal kök hücrelerinde hox ve tale transkripsiyon faktörleri: Gen ifadeleri ve protein etkileşimleri
HOX/TALE proteins maintain tissue identity and their altered expression is seen in many cancers. The main aim of this thesis is to evaluate whether HOX/TALE gene expression changes due to genomic instability. To answer this question, Fanconi anemia (FA) bone marrow mesenchymal stem/stromal cells (BM-MSCs) were investigated. FA is an inherited bone marrow (BM) failure disease, which shows cancer predisposition due to genomic instability. FA BM-MSCs were characterized at molecular and cellular level compared to donors. The gene expression profile was evaluated by RT-qPCR. Differentially expressed gene was further analyzed to define its function related to BM-MSCs biology, as well as, to assess its interactions with the members of FA/BRCA pathway using co-immunoprecipitation (Co-IP). PKNOX2 expression significantly decreased in FA cells compared to donors, and its expression was stimulated by rTGF-β1 treatment. When BM-MSCs, transfected with PKNOX2 expression plasmid (PKNOX2:MSC) were characterized, decrease in CD105 level and lateral motility were observed. Co-culture assays of cryopreserved CD34+HSCs on PKNOX2:MSCs displayed increase in CD34+CD38+ percentage and clonogenic capacity. Proteome analysis following Co-IP revealed that a total of 219 proteins directly interacted with PKNOX2, but FA/BRCA pathway members were not among these proteins. However, interactors of PKNOX2 interactome may regulate double-strand break repair via NHEJ, HSC differentiation and G2/M transition. In conclusion, decrease in PKNOX2 expression of FA BM-MSCs may cause cell cycle arrest, increase in NHEJ-related gene expression and trigger the formation of genomic unstable microenvironment that can promote hematopoietic defects seen in patients.
Hücre tabaka mühendisliği ile göbek kordonu perisitlerinden üç boyutlu damar grefti eldesi
Otolog damarlara erişilebilirliğin sınırlı olması ve sentetik iskelelerin sahip oldukları dezavantajlardan dolayı, koroner arter hastalıklarının tedavisi için, hücrelerin ve doğal malzemelerin birleştirilmesiyle oluşturulmuş küçük çaplı damar greftlerine (KÇDG) ihtiyaç duyulmaktadır. Bu tez çalışmasının amacı, üç boyutlu KÇDG modeli oluşturmaktır. Bu amaç doğrultusunda, CD146+ perisitler, insan göbek kordonu veninden izole edilerek düz kas hücrelerine ve fibroblastlara farklılaştırılmıştır. Bu hücreler, kollajen tip I/elastin/dermatan sülfat ve kollajen tip I/fibrin ile birleştirilerek sırasıyla tunika medya ve tunika adventisya-benzeri tabakalar oluşturulmuştur. Fibronektin ve heparin kaplaması sonrası, hücre tabaka mühendisliği yöntemiyle insan göbek kordon veni endotel hücreleri bu yapı üzerine ekilmiş ve tunika-intima benzeri tabaka oluşturulmuştur. İnsan göbek kordon kanı CD34+ hücreleri, trombosit yönünde farklılaştırılarak adezyon testi ile intima tabakasının anti-trombojenik özelliği gösterilmiştir. İmmün işaretleme, histokimyasal boyama, taramalı ve geçirimli elektron mikroskobu (SEM ve TEM) kullanılarak damar yapısı karakterize edilmiştir. SEM ve TEM analiziyle damar yapısında bulunan üç tabakanın varlığı, immün işaretleme ile bu tabakalarda yer alan düz kas hücreleri (α-SMA), fibroblastlar (Tenascin-C) ve endotel hücreleri (VEGFR1) gösterilmiştir. Bu tez çalışması, oluşturulacak olan doğal KÇVG'ler için, perisitlerden farklılaştırılan damar hücreleri ve doğal malzemeleri birleştirerek bir damar modeli meydana getirmesi yönünden önem taşımaktadır.
İn vitro kültür ortamında kemik iliği nişi modellenmesine yönelik çalışmalar
Mezenkimal kök hücreler (MKH), preklinik araştırmalar, klinik çalışmalar ve yeni araştırma ilacı başvurularında en yaygın kullanılan kök hücre tipidir. İnsanlarda MKH izolasyonu başlıca kemik iliği ve adipoz dokudan yapılmakta olup, izole edilebilir MKH miktarı tüm çekirdekli hücrelerin yalnızca %0.001-3'lük kısmını oluşturmaktadır. Bu nedenle yeni izolasyon yöntemleri ve kaynaklarına ihtiyaç duyulmaktadır. Bu tez kapsamında ilk bölümde, kemik iliği nakli sırasında kullanılan ve sonrasında tıbbi atık olarak uzaklaştırılan filtre ve torba sistemlerinin MKH kaynağı olarak uygunluğu araştırılmıştır. Kök hücre uygulamalarında güncel yaklaşım, sistemik ve/veya bölgesel olarak doğrudan MKH uygulanması yerine "cell-free therapy" olarak adlandırılan MKH kaynaklı biyoaktif bileşenlerin kullanılmasıdır. Çalışmamızın ikinci aşamasında, kök hücre nişinin temelini oluşturan, MKH kaynaklı biyoaktif bileşenlerden olan ekstraselüler matriks yapısının üretimi ve güncel doku mühendisliği uygulaması olan çeşitli deselülerizasyon yöntemleri ile izolasyonu, mikroskobik inceleme çalışmaları, kalıntı DNA miktarı ve glikozaminoglikan içeriği açısından değerlendirilmiş ve proteomik tekniklerle yapısı aydınlatılmıştır. Elde edilen sonuçlara göre, "kullanılmış" filtre ve torba sistemleri, özgül antijen ifadesine sahip, adipojenik, osteojenik ve kondrojenik farklılaşma potansiyeli bulunan MKH izolasyonu için önemli bir kaynak oluşturmaktadır. Osteojenik farklılaşma besiyeri ile EM üretimi sonrasında Triton X-100, NH4OH içeren çözelti ile deselülerizasyon yöntemi ile insan trabeküler kemik morfolojisi benzeri MKH-dEM izole edilmiş ve nLC-MS/MS yöntemi ile MKH-dEM kompozisyonunda yer alan 2005 farklı protein tanımlanmıştır. EM yapısını oluşturan, bağlantılı olan ve düzenlenmesinde rol alan önemli proteinler insan matrizom veritabanı ile karşılaştırılarak analiz edilmiştir. Anahtar Kelimeler: Rejeneratif tıp, kemik iliği nişi, mezenkimal kök hücre, ekstraselüler matriks, deselülerizasyon, doku mühendisliği (*) Bu çalışma THD-12181 numaralı Hacettepe Üniversitesi Bilimsel Araştırmalar Koordinasyon Birimi projesi tarafından desteklenmiştir.
Mezenkimal kök hücrelerin diamond blackfan anemisi hastalığındaki rolünün araştırılması
Bu tez çalışmasında, Diamond Blackfan Anemisi hastalığının moleküler etiyolojisi aydınlatılmaya çalışılmıştır. Bu amaç doğrultusunda; etkilenmiş bireylerin kemik iliği kaynaklı mezenkimal ve hematopoetik kök hücreleri sağlıklı donörler ile karşılaştırmalı olarak incelenmiştir. DBA hastalarına ait mezenkimal kök hücrelerin proliferasyon hızlarında azalma ve farklılaşma potansiyelinde eksiklik olduğu gösterilmiştir. Transkriptom analizleri DBA hastalarına ait mezenkimal kök hücrelerde artmış bir inflamatuvar cevap olduğuna işaret etmiştir. Osteojenik farklılaşma sonucunda yapılan transkriptom analizi ise RPS19 mutasyonu bulunan bireyde erken ve orta dönem osteojenik belirteçlerin arttığı, son dönem belirteçlerin ise azaldığı 'geciken' osteogenezi ortaya koymuştur. Kemik iliği kaynaklı mononüklear hücreler ile yapılan CFU-E deneyinde sadece tek bir DBA hastasından koloni elde edilebilmiş, transkriptom verilerine bakıldığında ise bu hücrelerde inflamasyon ve immün sistemle ilişkili olan genlerde ifade değişimleri olduğu görülmüştür. İmmünfenotipleme çalışmasında RPS19 mutasyonu bulunan bireyin proeritroblast yüzdesinde azalma olduğu saptanmış, bu hücrelerde yapılan transkriptom analizi ile, mRNA düzenlenmesi, RNA işlemesi ve ribozom biyogenezi gibi işlevlerden sorumlu olan genlerde ifade değişimleri olduğu saptanmıştır. Özellikle alt üniteyi oluşturan proteinleri kodlayan genlerdeki azalma dikkat çekicidir. Tez çalışması sonucunda elde edilen bilgilerin sadece DBA değil, diğer kemik iliği yetmezlikleri için de kritik öneme sahip olduğu düşünülmektedir. Bununla beraber, ribozomopati grubundaki diğer hastalıklarda benzer yaklaşımlar ile elde edilecek olan omik seviyesindeki bilgiler sadece ribozomopatiler değil, kanser, farklılaşma ve immün regülasyon gibi önemli mekanizmaları aydınlatma adına önemli olacaktır.
Değişik kaynaklı MKH'lerin detaylı karakterizasyonu, lenfohematopoezi destekleyici özellikleri ve izolasyonunda cd271 antijeninin önemi
Mezenkimal Kök Hücreler (MKH), kendini yenileyebilen multipotent hücrelerdir ve rejeneratif tedavilerin temelini oluşturmaktadır. CD271 antijeni, kemik iliğinden (Kİ) saf MKH izolasyonu için kullanılan en etkin belirteçtir. Bu tez kapsamında; CD271 antijeni kullanılarak insan Kİ'nden MKH izolasyonu ve karakterizasyonu yapılmıştır; plastiğe aderan Kİ-MKH ve CD271+ kök hücrelerin (KH), koloni oluşturma kapasitesi, immün profili, proliferatif ve farklılaşma kapasiteleri kıyaslanmıştır. Ayrıca CD271 antijeninin, fetal dokulardan saf MKH izolasyonu için kullanılıp kullanılamayacağı araştırılmıştır; Kİ-kaynaklı MKH ve CD271+ KH'lerin fonksiyonu ve lenfohematopoetik desteği karşılaştırılmıştır; lenfohematopoetik farklılaşmasına desteğini anlamak için NOTCH reseptör ve ligandların ifadelerine bakılmıştır. CD271 antijeni düşük oranlarda Kİ'nde ifade edilse de, CD271+ KH'ler; Kİ'nin tüm koloni oluşturma kapasitesine sahip ve aderan Kİ-MKH'ler ile benzer bir immünofenotip, farklılaşma profili, sitokin salınımı ve NOTCH reseptör ve ligand ifadeleri göstermekte olup, benzer şekilde hematopoetik hücre desteğini sağlamaktadır. Ancak, CD271 antijeni Kİ'nden saf MKH'lerin izolasyonunda kullanılabilirken, fetal dokulardan saf MKH izolasyonu için kullanılamamaktadır. Bu sebeple; plasenta koryon (PK), plasenta amniyon (PA) ve göbek kordonundan (GK) MKH saflaştırılması için farklı izolasyon ve/veya kültür koşullarının optimizasyonu gerekmektedir. Medyuma salınan sitokin profiline ve NOTCH reseptör ile ligand ifadelerine bakıldığında, CD271+ KH'ler ve Kİ-MKH'ler birbirine yakındır. Ancak, fetal dokulardan izole edilen MKH'lerin profilleri birbirine yakın iken, Kİ'nden izole edilen MKH'lerden belirgin farklar göstermektedir. Bu farklar; ex vivo Hematopoetik kök hücre'lerin (HKH) çoğaltılması ve lenfohematopoetik farklılaşmaya olan desteği bakımından büyük önem taşıdığı için, klinik açıdan tartışılmıştır.
Hipoksinin kanser kök hücrelerine etkisinin incelenmesi
Hipoksi, oksijen eksiği olarak tanımlanan bir ortamdır ve kanser kök hücrelerinin karakterinin devamlığını sağlaması nedeniyle tümörlerde önemli bir role sahiptir. Bu çalışmanın amacı, kanser kök hücrelerinin 2 boyutlu (2B) ve 3 boyutu (3B) kültürlerde hipoksik şartlar altında davranışlarını ve karakterlerini incelemektir. Çalışmada, CD133 yüzey proteini ile karakterize edilmiş olan osteosarkoma kanser kök hücreleri, manyetik aktiflenmiş hücre ayırım (MACS) tekniği ile osteosarkoma kanser kök hücrelerinden izole edilmiştir. Kontrol grubu olarak da satın alınmış olan osteosarkoma kanser kök hücre hattı (OKKH, Celprogen Inc.) kullanılmıştır. OKKH, CD133+ ve CD133- hücreler 3 gün boyunca hipoksik (%1 O2) ve normoksik (%21 O2) koşullarda kültive edilmiştir. 3B model için bakteriyel selüloz doku iskelesi kullanılmıştır. Hücrelerin 3 boyutlu morfolojileri SEM analizi ile incelenmiş, kantitatif PCR, ALP aktivitesi ve immünohistokimyasal boyama ise kanser kök hücrelerinin 2B ve 3B olarak hipoksik şartlar altında karakterlerinin incelenmesi için uygulanmıştır. Hücre canlılığı 3. ve 7.günlerde MTT analizi ile gösterilmiştir. Bu çalışma, kanser kök hücre davranışını ve in vitro tümörigenezin çalışılması için bir 3B hipoksik tümör model olarak da tanımlanabilir. Bu tez projesi Aliye Üster Vakfı tarafından desteklenmiştir.
Regülatör hücrelerin kronik böbrek hastalığına bağlı vaskülopatideki rolü
Kronik Böbrek Hastalığında (KBH) en önemli morbidite ve mortalite nedeni kardiyovasküler hastalıklardır (KVH). KBH'li çocuklarda KVH, gizli ve sinsi olarak başlamaktadır. KVH oluşumunda metabolik ve immünolojik faktörler sorumlu tutulmaktadır ve kardiyovasküler tutulumun KBH'nin hangi evresinde başladığı, sıklığı ve nedeni hakkında kanıtlanmış kesin bir bilgi yoktur. İmmün sistem hücrelerinden T lenfosit ve alt gruplarının ( Th1, Th2, Th17 ), B lenfosit ve alt gruplarının ve bu hücrelerden salınan sitokinler aracılığıyla KBH'ye bağlı KVH ve ateroskleroza katkısı olduğu bildirilmiştir. Fakat immün sistemin hücrelerinin ve salgıladıkları sitokinlerin KVH ve aterosklerozdaki hücresel mekanizması hakkında net bir bilgi yoktur. Bu tez çalışmasında da KBH'ye sahip çocuklarda kardiyovasküler tutulum risklerinin değerlendirilmesi için AIx (Augmentasyon İndeksi), PWV (Nabız Dalga Boyu), CIMT (Karotis İntima-Media Kalınlığı), SVKİ (Sol Ventrikül Kitle İndeksi) gibi arteriyal kalınlık belirteçleri kullanılarak tutulumun hastalığın hangi evresinde başladığı ve bu evrelerdeki Treg (Regülatör T hücresi) hücre düzeyinin tutulumla ilişkisi araştırılmak istenmiştir. Her hastaya ve kontrol grubuna yukarıda sayılan kardiyovasküler tutulum değerlendirme testleri ve Treg hücre düzeyini saptamak için flow sitometrik test uygulanmıştır. Hastaların öncelikle K/DQOI kriterlerine göre KBH evrelendirilmesi yapılmıştır. Hastalar evrelerine göre İki gruba ayrılmıştır. Evre 1,2,3 olanlar grup 1'e; evre 4,5 olanlar grup 2'ye alınmıştır. Grup 1 (n:12) ve grup 2'ye (n:13) alınan her hastada kardiyovasküler tutulum parametreleri değerlendirildiğinde ortalama AIx, ortalama PWV, ortalama CIMT, ortalama SVKİ değeri sağlıklı gruba göre yüksek ve istatistiksel olarak anlamlı saptanmıştır (p<0,05). Grup 1 ve grup 2 kendi aralarında karşılaştırıldığında ortalama AIx değerinin grup 2'de grup 1'ye göre anlamlı yüksek olduğu (p<0,05); ortalama PWV, ortalama CIMT ve ortalama SVKİ değerinin de yüksek olduğu ama istatistiksel bir anlamı olmadığı saptanmıştır (p>0,05). Literatürde KBH'ye bağlı KVH'de Treg hücrelerin hücresel mekanizmada rolünün olup olmadığını bildiren herhangi bir yayın yoktur. Bu çalışmamızda hastalığın evresi arttıkça kardiyovasküler tutulumun arttığı ve Treg hücrelerin düzeyinin düştüğü saptanmıştır. Bu sonuçtan yola çıkarak Treg hücrelerin KBH'li çocuklarda kardiyovasküler tutulumda rolü olabileceğini düşünmekteyiz. Bu tez çalışmasında elde edilen sonuçlar önerilen hipotezi destekler niteliktedir. Hastalığın evresi arttıkça Treg hücre düzeyinin anlamlı derecede düştüğü ve kardiyovasküler riskin de arttığı saptanmıştır.
Gemsitabin dirençli ve dirençsiz küçük hücreli dışı akciğer kanseri kökenli kanser kök hücrelerinden türetilen eksozomlarda miRNA 221/222 kümesi profilinin incelenmesi
Amaç: Bu tez çalışmasının amacı, Gemsitabin dirençli kanser kök hücreleri (d-AKKH; CD326+ CD133+ CD44+) ve eksozomlarında (d-AKKH-Exo) miRNA 221/222, MDR1, ABCG2 ve Bcl-2 genlerinin ekspresyonunu araştırmak ve dirençsiz kanser kök hücreleri (AKKH; CD326+ CD133+ CD44+) ve eksozomları (AKKH-Exo) ile karşılaştırılarak miRNA 221/222'nin Gemsitabin direncinde etkisini belirlemektir. Yöntem: A549 hücrelerinde CFU yöntemi ile Gemsitabin direnci geliştirilerek (d-A549), CD326+ CD133+ CD44+ KKH izolasyonu yapıldı ve tümörsferoid tipte çoğaltıldı. Daha sonra flow sitometri, immunofloresan, qRT-PCR, büyüme eğrisi ve MTT yöntemleri ile karakterizasyon işlemleri tamamlanmış AKKH ve d-AKKH tümörsferoidlerinden eksozom izolasyonu ve karakterizasyonu yapıldı. Son aşamada AKKH, AKKH-Exo, d-AKKH ve d-AKKH-Exo'larında miRNA 221/222, MDR1, ABCG2 ve Bcl2 genlerinin ekspresyonu qRT-PCR yöntemi ile incelendi. Bulgular: d-A549 hücrelerinde CFU analizi ile belirgin ve canlılık oranı yüksek koloni oluşturma yetenekleri gösterildi. A549 ve d-A549 hücrelerinden izole edilen CD326+ CD133+ CD44+ KKH'lerinde yüksek saflık ve canlılık belirlenerek 3D kültür ortamında çoğaltıldı. Karakterizasyon analizlerinde AKKH hücrelerine göre d-AKKH'lerde daha yüksek MDR1 ve ABCG2 aktivasyonu, OCT4 gen ekspresyonu, daha yüksek proliferasyon ve IC50 değerleri belirlendi. Tüm deney gruplarında yapılan qRT-PCR analizinde d-AKKH-Exo'larında yüksek oranda MDR1 ve Bcl-2, miR-221-3p, miR-222-3p ve miR-222-5p ekspresyonu belirlendi. Sonuç: Bu tez çalışmasında miR-221/222 ekspresyon düzeyinin akciğer kanserinde Gemsitabin direnci ile yakından ilişkili olabileceği ve miR-222-5p'nin dirençli akciğer kanserinde erken biyobelirteç olabileceği sonucuna ulaşıldı.
Ön koşullandırma ile eğitilmiş insan Warton jeli kökenli mezenkimal kök hücrelerin immunoterapötik yeteneklerinin araştırılması
Başlık: Ön Kоşullandırma ile Eğitilmiş İnsan Whartоn Jeli Kökenli Mezenkimal Kök Hücrelerin İmmunоterapötik Yeteneklerinin Araştırılması Amaç: Bu tez çalışmasının amacı, immünmodülatif özellikleri bakımından diğer mezenkimal kök hücre (MKH) kaynaklarına göre belirgin avantajlara sahip olan insan göbek kordonu bağ dokusundan elde edilen Wharton jeli MKH'lerinin (iWJ-MKH), önemli bir pro-inflamatuar sitokin olan interferon gama (IFN-γ) ile önkoşullandırılarak immünosupresif etkinliğinin artırılmasını sağlamak ve bu etkinin in vitro bağışıklık sistemi modeli olarak kullanılan insan T hücreleri üzerinde detaylı biçimde değerlendirilmesidir. Yöntem: Periferik kandan izole edilen ve in vitro bağışıklık sistemi modeli olarak kullanılmak üzere PHA ile aktive edilen T hücreleri, IFN-γ ile önkoşullandırılmış iWJ-MKH'ler ile kokültür edildi. Önkoşullandırma sonrası iWJ-MKH'lerde IDO ve PGE2 düzeyleri ELISA yöntemiyle kantitatif olarak analiz edildi. IFN-γ'nın iWJ-MKH'lerin T lenfositler üzerindeki immünosupresif etkisine katkısını değerlendirmek amacıyla kokültür sonrası; hücre canlılığı ve proliferasyonu (CCK-8), apoptoz oranı (Annexin V/PI boyama), hücre döngüsü dağılımı (flow sitometri ile hücre döngüsü analizi), anti ve pro-inflamatuar sitokin düzeyleri (TGF-β1, IFN-γ), regülatör T hücre (Treg; CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺) oranı, T-bet düzeyi ve T hücrelerine özgü yüzey belirteçleri/gen ekspresyonları (CD3, CD4, CD25, CD45, CD4⁺CD8 ve CD69) analiz edildi. Bulgular: IFN-γ ile önkoşullandırılan iWJ-MKH'lerde IDO ve PGE2 düzeylerinde anlamlı bir artış tespit edildi. Kokültür uygulaması sonrasında ise T hücrelerinde proliferasyonun azaldığı, apoptoz oranının arttığı ve Treg hücre oranında belirgin bir yükseliş olduğu gözlemlendi. Sonuç: Elde edilen bulgular, IFN-γ ile önkoşullandırılan iWJ-MKH'lerinin immünomodülatör kapasitesinin arttığını ve T lenfosit yanıtlarını baskılama yeteneklerinin güçlendiğini göstermiştir. Ayrıca, bu immünosupresif etkinin uygulanan doz ve maruziyet süresine bağlı olarak artış gösterdiği belirlenmiştir. Anahtar Kelimeler: İnsan göbek kordonu kök hücreler, interferon gama, ön koşullandırma, hücresel tedavi, immünosüpresif tedavi.
İlaçla uyarılmış karaciğer hasarında mezenkimal kök hücre kaynaklı rejeneratif etkinin araştırılması
Bаşlık: İlаçlа uyаrılmış kаrаciğеr hаsаrındа mеzеnkimаl kök hücrе kаynаklı rеjеnеrаtif еtkinin аrаştırılmаsı. Аmаç: Kаrаciğеr, mеtаbоlizmа, dеtоksifikаsyоn vе hоmеоstаzdа mеrkеzi işlеvlеri оlаn hаyаti bir оrgаndır. Mеzеnkimаl kök hücrе (MKH) tеrаpisi, kаrаciğеr hаsаrlаrının tеdаvisindе umut vаdеdеn bir yаklаşımdır. Bu çаlışmаdа, Whаrtоn jеli kаynаklı MKH'lеrin (WJ-MKH) аsеtаminоfеn (АPАP) ilе indüklеnеn hеpаtоtоksisitе üzеrindеki pоtаnsiyеl rеjеnеrаtif еtkilеri in vitrо kоşullаrdа аrаştırılmıştır. Yöntеm: WJ-MKH dоz оptimizаsyоnu gеrçеklеştirildiktеn sоnrа, kаrаciğеr fizyоlоjisini tаklit еdеn mikrоаkışkаn bir mоdеldе hеpаtоsit, еndоtеl hücrеlеri vе WJ-MKH'dеn оluşаn üçlü hücrе kültürü оluşturulmuştur. АPАP'ın fаrklı kоnsаntrаsyоnlаrının еtkilеri MTT sitоtоksisitе tеstiylе dеğеrlеndirilmiş, IC50 dеğеri bеlirlеnmiştir. Оptimum dоzdа cаnlı/ölü hücrе bоyаmаlаrı vе аpоptоz аnаlizlеri gеrçеklеştirilmiştir. İmmünоflоrеsаn bоyаmаlаrlа АFP, NRF2, HNF4α vе VЕ-Kаdеrin bеlirtеçlеrinin еksprеsyоnlаrı incеlеnmiştir. Bulgulаr: АPАP uygulаmаsı hücrе cаnlılığını аzаltmış, üçlü kültür mоdеli isе hücrеsеl bütünlüğü kısmеn kоrumuştur. АFP vе NRF2 еksprеsyоnlаrındаki dеğişikliklеr, hücrеlеrin hеpаtоtоksisitеyе kаrşı sаvunmа mеkаnizmаlаrını аktivе еttiğini göstеrmiştir. HNF4α vе VЕ-Kаdеrin düzеylеrindе isе bаzı kоşullаrdа аzаlmа gözlеnmiştir. Dinаmik kültür оrtаmı, stаtik mоdеlе kıyаslа bаzı bеlirtеçlеrdе fаrklılаşmаlаrа yоl аçmıştır. Sоnuç: WJ-MKH'lеrin АPАP ilе оluşturulаn kаrаciğеr hаsаrındа rеjеnеrаtif yаnıtı dеstеklеyеbilеcеği, üçlü kültür mоdеlinin vе dinаmik mikrоçеvrе kоşullаrının dаhа fizyоlоjik yаnıtlаr еldе еtmеktе аvаntаj sаğlаyаbilеcеği dеğеrlеndirilmiştir. Bu tеz çаlışmаsı BАP TYL-2024-3141, TUBİTАK 1004 20АG003 vе 20АG031 vе TUBİTАK 2218 122C158 prоjеlеri ilе dеstеklеnmiştir. Аnаhtаr Kеlimеlеr: Аsеаtminоfеn, MTT, Whаrtоn jеli kаynаklı mеzеnkimаl kök hücrе, İlаcа bаğlı kаrаciğеr hаsаrı
İnsan olfaktör mukozadan elde edilen nöral kök hücrelerin dopaminerjik nöron benzeri hücrelere farklılaştırılması
Başlık: İnsan olfaktör mukozadan elde edilen nöral kök hücrelerin dopaminerjik nöron benzeri hücrelere farklılaştırılması Amaç: Bu tez çalışmasında, in vitro kök hücre izolasyonu yöntemleri gerçekleştirilerek; insan olfaktör mukozadan (iOM) nöral kök hücrelerin izole edilmesi, çoğaltılması ve karakterizasyon analizlerinin gerçekleştirilerek, belirli nörotrofik faktörlerin etkisi altında in vitro ortamda dopaminerjik nöron benzeri hücrelere farklılaştırılması amaçlanmıştır. Yöntem: İnsan olfaktör mukozadan nöral kök hücreler (iO-NKH) izole edilip, karakterizasyonları için immunofenotipik ve MTT analizleri gerçekleştirildi. iO-NKH'ler, 3B kültüre edilerek nörosferik yapılar oluşturuldu. Nörosferlerin karakterizasyon analizleri için immunofenotipik ve nöronal farklılaştırma analizleri gerçekleştirildi. Daha sonra iO-NKH'ler in vitro dopaminerjik nöron benzeri hücrelere farklılaştırıldı. Farklılaştırma analizi sonrası, dopaminerjik nöron benzeri hücrelerin immunofenotipik ve genotipik karakterizasyon analizleri yapıldı. Bulgular: iOM'den NKH izolasyonu gerçekleştirilerek NKH'lere özgü hücre belirteçlerinin (CD56, CD133, SOX2 ve NESTİN) pozitif ekspresyonları gösterildi. Karakterizasyon analizleri için nöronal ve glial yönde farklılaştırılan nörosferlerin, nöronal ve glial hücrelere özgü hücre belirteçleri (TUBB3, GFAP, NG2) immunofloresan işaretleme ile pozitif olarak gösterildi. İn vitro dopaminerjik nörona farklılaştırılan iO-NKH'lerin dopaminerjik nörona özgü protein (TH) ve gen (Dat, TH, Pitx3, Nurr1) ile karakterizasyonu için immunositokimyasal ve qRT-PCR analizleri gerçekleştirildi. Sonuç olarak dopaminerjik nörona özgü proteinin (TH) pozitifliği ve genlerinin (Dat, TH, Pitx3, Nurr1) ekspresyonunun anlamlı ölçüde arttığı gözlendi. Sonuç: Elde edilen sonuçlara göre, nörodejeneratif hastalıklarda hücre replasman tedavilerinde kullanılabilecek, hücre kültürlerine dayanıklı, nöronal ve glial yönde farklılaşma gösteren, elde edilmesi kolay ve az maliyetli nöral kök hücre kaynağı oluşturulabileceği sonucuna ulaşıldı.