Theses supervised by Prof. Dr. Abdullah Tuli
12 theses · Çukurova University
Moleküler laboratuvarda kalite kontrol ve akreditasyona ön hazırlıkta yapılan iyileştirme çalışmaları
Amaç: Moleküler genetik testlerin klinik tanıyı belirlemede önemli katkıları bulunmaktadır. Bu testleri yapan moleküler genetik tanı laboratuvarlarının sayısının her geçen gün artması ve bu alandaki teknolojik gelişmeler, ilk gereksinimi ve kullanımı endüstriyel alanda ortaya çıkan, sonrasında sağlık hizmetlerinde ve bunun önemli bir parçası olan tıbbi laboratuvarlarda da uygulanması yaygınlaşan toplam kalite yönetimi ve kalite standartlarının moleküler ve genetik tanı laboratuvarlarında kullanımını gerekli hale getirmiştir. Moleküler testler klinik tanının neredeyse vazgeçilmez bir parçası haline gelmiştir. Bu nedenle verilen test sonuçlarında hata yapmamak ve güvenilir sonuçlar vermek moleküler genetik tanı laboratuvarlarının vazgeçilmez politikası olmalıdır. Bu politikayı gerçekleştirmek ve geçerliliği her yerde aynı olan test sonuçları verebilmek için bir takım kalite standartlarının yerine getirilmesi zorunludur. Akreditasyon da bunu gerçekleştirmede önemli bir araçtır.Bu çalışmadaki amacımız, 1992 yılından beri hizmet vermekte olan Moleküler ve Biyokimyasal Genetik Tanı İstasyonumuzun akreditasyon standartları uyarınca şu anki durumunu ve eksikliklerini tespit edebilmekti. Yapılan tespit sonrasında standartların gerektirdiği şekilde belgeleri hazırlamaya yönelik bir ön çalışma yapmak ve bir moleküler genetik tanı laboratuvarının akreditasyonu konusunda ön bilgiler verebilmekti.Gereç ve Yöntemler: Bu tez çalışmasında, Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Biyokimya Anabilim Dalı'na bağlı hizmet veren Moleküler ve Biyokimyasal Genetik Tanı İstasyonu'nda, akreditasyona ön hazırlık kapsamında ISO 15189 ve JCI standartlarının öngördüğü şekilde, öncelikle mevcut durum tespit edilmiş, sonra belirlenen eksikliklere göre belgelendirme çalışmaları yapılmış ve önerilerde bulunulmuştur.Bulgular: Bu çalışmayla, iş-akış şeması hazırlanarak, işleyiş süreci belirlenmiş, anket çalışması yapılarak da hizmet süreci hakkında laboratuvar çalışanlarının ve prenatal tanı ailelerinin görüşleri alınmıştır. Sonrasında laboratuvar el kitabı hazırlanarak laboratuvarın yapısı ve çalışma süreci, prenatal tanı işleyiş kılavuzu ile prenatal tanı hizmetinin kapsamı ve örnek prosedür, talimat ve formlar aracılığıyla da laboratuvar çalışmalarının belgelendirilmesi sağlanmıştır.Sonuç: Yapılan bu ön çalışma ile moleküler tanı laboratuvarının akreditasyon süreci için eksikliklerinin tespit edilmesine ve buna yönelik bir takım düzeltici faaliyetler açısından ön hazırlıklar ve öneriler yapılmasına çalışılmıştır. İleri dönemde akreditasyon için hazırlık yapmak isteyenlere örnek olabilmesi yönünden örnek prosedür, talimat ve formlar hazırlanarak bu konuda fikir verici ve öncü olunmaya çalışılmıştır.Anahtar Sözcükler: moleküler laboratuvar, kalite kontrol, akreditasyon, belgelendirme
Anne kanında fetal nükleik asitlerle prenatal tanı uygulamas
Maternal dolaşımda serbest fetal DNA'nın bulunması ile geçtiğimiz on yılda girişimsel olmayan prenatal tanıda gelişmeler kaydedilmiştir. Fetüste paternal alellerin serbest fetal DNA'da tanımlanmasına yönelik çalışmalar artık kullanılmaya başlanmıştır. Maternal plazmada fetal DNA analizinde HRM eğrisi analizi girişimsel olmayan prenatal tanı için büyük bir potansiyel oluşturmaktadır.Elli ikisi orak hücre, 32'si beta talasemi taşıyıcısı ve 15'i sağlıklı kontrol olmak üzere toplam 104 primigravidanın maternal plazma örneğini çalıştık. Fetal DNA, 1 mL plazma örneğinden elde edildi; erkek fetüsleri saptamak için Y kromozomuna özgül SRY ve DYS14 belirteçleri ?nested? PCR ve RT-PCR ile analiz edildi. Fetal ve total DNA kantitasyonu sırasıyla DYS14 ve beta globin genleriyle yapıldı. Girişimsel prenatal tanıdaki geleneksel yöntemlere seçenek olarak hemoglobinopatilerde HRM analizi ile fetal DNA genotiplendirilmesi yapıldı.Maternal plazmada gebeliğin erken döneminde fetal DNA (DYS14), RT-PCR ile % 100 oranında erkek taşıyan gebede saptandı; SRY dizisi kullanarak ?nested? PCR ile bu oran % 93,7 olarak bulundu. Maternal plazma total (beta globin) ve fetal DNA düzeyleri gebelik haftası ile artış gösterdi. Orak hücre taşıyıcısı gebelerde fetal DNA düzeyi, kontrol ve talasemi grubuna göre artan MoM değerleri gösterdi. Talasemi taşıyıcısı gebelerde total DNA miktarında, kontrol ve orak hücre taşıyıcısı gruba göre azalan MoM değeri gözlendi (p<0,001). Gebeliğin geç döneminde, orak hücre taşıyıcısı, talasemi taşıyıcısı ve kontrol grupları arasında beta globin düzeylerinin anlamlı olarak arttığını saptadık. Fetal DNA'nın HRM ile genotiplemesi paternal alellerin maternal DNA'dan ayrımı ile yapıldı. Fetüsün anneyle aynı genotipi taşıdığı durumlarda kısmen de olsa sorunlar yaşandı.Sonuçlarımız hemoglobinopatili gebeliklerin erken döneminde, fetal ve total DNA düzeylerine bakmanın anlamlı olmadığını gösterdi. Hemoglobinopatilerin prenatal tanısında girişimsel yöntemlere seçenek olarak fetal DNA'nın genotiplendirilmesinde fetüsün anneden farklı paternal aleller taşıdığı durumlarda HRM analizinin kullanışlı olabileceğini göstermektedir.
Hipertansif ve normotansif bireylerde anjiyotensin dönüştürücü enzim ve G proteini sinyal düzenleyici 2 genlerindeki polimorfizmlerin incelenmesi
Amaç: Hipertansiyon yol açtığı morbidite ve mortaliteden dolayı önemli bir halk sağlığı problemidir. Etiyolojisine göre primer (esansiyel) ve sekonder hipertansiyon şeklinde iki gruba ayrılmaktadır. Sekonder hipertansiyon daha az sıklıkta görülmekte olup, nedeni belirlenebilirdir. Esansiyel hipertansiyonun temel nedeni bilinmemektedir. Biz de çalışmamızda, esansiyel hipertansiyonun genetik etiyolojisini aydınlatmaya yönelik, ACE I/D polimorfizmi ve RGS2 gen polimorfizmlerinin hipertansiyonla ilişkisini araştırmayı amaçladık. Gereç ve Yöntem: Çalışmamıza 53 esansiyel hipertansiyonlu ve 53 normotansif olmak üzere 106 birey dahil edildi. ACE I/D polimorfizmi ARMS yöntemiyle değerlendirilir iken RGS2 gen polimorfizmlerini incelemek üzere için dizi analizi yapılmıştır. Bulgular: Hipertansiyon aile öyküsü, alkol kullanımı ve beden kitle indeksi ile ilişkili saptandı (p<0,05). ACE I/D polimorfizminin hem beden kitle indeksi hem de hipertansiyon arasında anlamlı bir ilişki saptanmadı (p>0,05). RGS2 geninde, 2?si yeni olmak üzere 10 adet polimorfizm saptandı. RGS2 geninde saptanan polimorfizmler ile hipertansiyon arasında anlamlı bir ilişki saptanmadı (p>0,05). Sonuç: Hipertansiyonun ACE I/D polimorfizmi ve RGS2 gen polimorfizmleri ilişkisini anlamsız saptadık. RGS2 geninin 5? üstü bölgesinde, başka çalışmalarda rastlamadığımız 2 adet yeni polimorfizm saptadık. Bu çalışma bir ön çalışma niteliğinde olup, daha geniş hasta grubunun genetik analizinin yapılması ve saptanacak değişimlerin gen ifadesi üzerindeki etkilerinin değerlendirilmesi literatüre katkı sağlayacaktır. Anahtar Sözcükler: Anjiyotensin Dönüştürü Enzim, Esansiyel hipertansiyon, G proteini sinyal düzenleyici 2, I/D polimorfizmi.
G6PDaktivitesi referans değerleri altında olan bireylerde gen ekspresyonlarının karşılaştırılması
Glukoz-6-fosfat dehidrogenaz pentoz fosfat yolunun ilk basamağını katalizleyen kilit bir enzimdir. Eritrositlerde NADPH oluşumu için tek kaynak pentoz fosfat yolu olup, G6PD eksikliğinde NADPH üretimi önemli ölçüde azalmaktadır. G6PD enzim eksikliği enfeksiyonlar sırasında, bazı ilaçların kullanımıyla, yeni doğan dönemde, bakla tüketimiyle ve stres koşullarında hemolitik anemiyle sonuçlanabilir. Enzim aktivitesi düşük olan olguların oksidatif ajanlara maruz kalması durumunda bazılarının eritrositlerinin etkilendiği, bazılarının etkilenmediği görülmüştür. Bu duruma açıklık getirebilmek için G6PD aktivitesi referans değerleri altında olan bireylerde G6PD enziminin kinetik özellikleri, genotipi ve G6PD geninin mRNA ekspresyon seviyeleri arasındaki ilişkinin değerlendirilmesi amaçlanmıştır. Çalışmamız, G6PD enzim aktivitesi referans aralığından düşük veya sıfır olan 3'ü kadın 7'si erkek 10 olgudan oluşmaktadır. G6PD aktivitesi Beutler yöntemi ile tayin edilmiştir. G6PD enzimi DE-52 anyon değiştirici reçine ile kısmi olarak saflaştırılarak kinetik özellikleri çalışılmıştır. Tüm olgularda MboII enzim kesimi ve sekans analizi ile Gd Akdeniz mutasyonu genotiplendirilmiştir. G6PD geninin ekspresyon seviyesi 2-ΔΔCt formülüne göre hesaplanmıştır. Elde edilen değişkenler Korelasyon testi ile değerlendirilmiştir. Çalışmamızda 4 hastada Gd Akdeniz mutasyonu belirlenmiş ve bunlardan 2 olgunun hemizigot, 2 olgunun da heterozigot olduğu bulunmuştur. Genin ekspresyon seviyeleri ile diğer değişkenler değerlendirilmiştir. Buna göre G6PD geninin ekspresyon düzeyi ile KmNADP arasında yüksek düzeyde, anlamlı pozitif bir ilişki olduğu, KmG6P arasında orta düzeyde, anlamlı pozitif bir ilişki olduğu belirlenmiştir. Bu da G6PD enziminin substrat bağlanma bölgesinin post-transkripsiyonel veya post-translasyonel modifikasyon geçirmiş olabileceğini düşündürmüştür.
Biyolojik uygulamalarda demir şelasyonu amacıyla kullanılabilir ligandların değerlendirilmesi
Vücutta aşırı biriken demiri uzaklaştırmak amacıyla Fe(III) iyonu ile bileşik oluşturabilecek ligantların sentezi\kompleksleşme derecesini ve insan plazmasından demirin uzaklaştırılmasında etkinliğinin belirlenmesi tedavi sürecinde klinikte kullanılabilme potansiyeli olan uygulamaların ilk basamağı niteliğindedir. Bu çalışma da ilk olarak asetilaseton üzerinde bulunan iki karbonil bileşiği arasındaki karbon atomu üzerindeki aktif hidrojen ile alkil gruplarının yer değiştirmesi ile farklı uzunluktaki zincir sayısına sahip asetilaseton türevleri olan 3-metil-2,4-pentandion ve 3-butil-2,4-pentandion başarılı bir şekilde sentezlendi ve ligand olarak kullanıldı. Kloralhidrat, hidroksilamin hidroklorür çıkış bileşiği olarak kullanılarak oksim gurubuna dahil olan anti-monokloroglioksim ve dimetilglioksim ligandları başarılı bir şekilde sentezlendi. 8-Hidroksikinolin-5-sülfonik asit, 4,5-Dihidroksibenzen-1,3-disülfonik asit, Piridin 2,6-Dikarboksilik, Nitrilotriasetik asit, Sitrik asit, Oksalat, Glisin, Salisilik asit' te ligand olarak kullanıldı. Demir ile kompleksleri safsu ve plazmada sentezlendi. Sentezlenen bileşiklerin yapıları FT-IR, manyetik suseptibilite, elementel analiz analiz ve UV-Vis gibi spektroskopik metodlar ile aydınlatılmıştır. Kompleksleşme derecesi ICP-MS ve UV-Vis yöntemleriyle belirlenmiştir. Komplekslerin, ligandların elektrokimyasal davranışları Siklik Voltametri ile incelendi. Daha sonra hücre kültürü yöntemi ile sentezlenen komplekslerin in vitro sitotoksik etkisi belirlenmiştir. MTT testi kullanılarak 12,5, 25, 50, 100 ve 200 μM'lık 5 farklı derişim aralığında kompleksler HUVEC hücre dizisi üzerine uygulanarak sitotoksik etkiye sahip olup olmadığı ve hücre proliferasyonuna etkisi incelenmiştir. Araştırmada kullanılan komplekslerin hemen hemen hepsinde artan dozlarda yüzde sitotoksisite cevapları arasında negatif bir ilişki gözlendi. Ayrıca komplekslerin birçoğunun HUVEC üzerine sitotoksik etkiye sahip olmadığı ve hücre proliferasyonunu etkilemediği hatta iyileştirici etkisi olduğunun tespit edilmesi ilaç geliştirme aşamasında deneysel hayvan modeli araştırması için ümit verici olarak görülmektedir. Bu çalışmada kullanılan ligandların şelasyona etkisinin araştırılması in vivo denemelerin gerçekleştirilebilmesinde ilk basamak çalışması olmuştur. İn vitro yapılan bu çalışmada bulunan sonuçlar ileriki dönemlerde in vivo çalışmalar ile de desteklenirse demir şelasyonuna uyumun optimum olacağı etkin demir şelatörlerin geliştirilmesini öngörmekteyiz.
Fetal cell-free DNA tayinine yönelik genosensör çalışması
21. yüzyılın laboratuvar teknolojisi olan biyosensörler klasik yöntemlere kıyasla sahip oldukları avantajlar sebebiyle yoğun ilgi görmektedir. Genetik analizlerde kullanılan biyosensörlere genosensör adı verilmektedir. Genosensörler rutin genetik analizler ile karşılaştırıldığında, polimeraz zincir reaksiyonuna (PCR) ve jel elektroforezi gibi zaman alıcı ve maliyetli işlemleri gerektirmemektedir. Bu çalışmanın amacı, maternal kandaki "cell-free" fetal DNA'dan paternal mutasyon tayini için nanopolimer bazlı genosensör ile yeni bir prosedür geliştirmektir. Kuvars-kristal mikrobalans (QCM) ve biyosensör teknolojilerini kullanılarak β-talasemi IVS1-110 mutasyonun analizine uygulanmıştır. Bu amaçla, mutasyona ait problar genosensör elektrodu üzerine Poli Hema-MAC nanopolimeri aracılığıyla bağlandı ve daha sonra örnekler tespit amacıyla çalışma hücresine eklendi. Genosensörün optimizasyon, karakterizasyon, duyarlılık ve özgüllük çalışmaları yapıldı. Geliştirilen biyosensör, yüzeyine bulunan proba özgül olarak fetüsün paternal mutasyon varlığını ortaya koyabilmektedir. Rutinde kullanılan geleneksel yöntemlerle karşılaştırıldığında, daha düşük maliyetli, hızlı sonuç verebilen, özgüllüğü ve saptama etkinliği yüksek olarak bulunmuştur.
Hidroksikumarin türevlerinin in vitro hemoglobin f indüklenmesi üzerine etkisi
β-talasemi ve orak hücre anemisi (OHA) dünyada yaygın görülen kalıtsal kan hastalıklarıdır. β-hemoglopinopatilerde tedavi seçenekleri yüksek maliyeti ve klinik komplikasyonları ile sınırlamalara sahiptir. β-talasemi ve OHA hastalarında fetal Hb'nin (HbF) artışı klinik şiddeti azaltmaktadır. Bu yüzden, γ-globin gen ekspresyonunu indükleyerek HbF'yi yeniden etkinleştirebilecek resveratrol gibi doğal veya sentezlenen polifenolik ve antioksidan ajanlar araştırmaların odak noktası haline gelmektedir. Çalışmamızın amacı, K562 hücre hatlarında dihidroksi-4-fenilkumarin türevlerinin HbF düzeyleri ve γ-globin gen ekspresyon aktivasyonu üzerine etkilerini irdelemektir. Çalışmada, hidroksiüre (HU) pozitif kontrol grubu olarak kullanıldı. Dihidroksi-4 fenilkumarin türevleri olan K1, K2, K3 ve K4 çalışma grubunu oluşturdu. Dihidroksi-4-fenilkumarin türevlerinin 4-fenil halkasında, (K1, K2) ve (K3, K4) sırasıyla hidroksi ve metoksi substitüye gruplar içeren moleküllerdir. HbF'in yeniden etkinleştirilmesi kapsamında K1, K2, K3, K4 ve HU'da hücre canlılık, total protein, total Hb, HbF ve γ-globin gen ekspresyon analizleri gerçekleştirildi. Çalışmada 7,8-dihidroksi-4-fenilkumarin türevleri, 6,7-dihidroksi-4-fenilkumarin türevlerine göre daha fazla sitotoksik etki gösterdi. 72. saatte elde edilen en yüksek HbF düzeyleri, 50 µM HU derişimde gözlenen değerler ile kıyaslandığın da K2>K3>K4≥K1>HU olup, γ-globin gen ekspresyon düzeyleri de 200 µM HU derişimde K2>K3>K1>K4>HU olduğu saptandı. En yüksek HbF düzeyi gösteren K2 0,8 µg/mL'nin γ-globin gen ekspresyon düzeyleri HU 200 µM'ye göre 6,3 kat artış yaptığı görüldü. 4-fenilkumarinlerde 7'nci ve 8'inci pozisyonlarda hidroksi substitüye grupları içeren moleküllerimizin γ-globin gen ekspresyon düzeyini artırdığı bulundu. Metoksi grupları varlığında gen ekspresyonunda azalmaya neden olabileceği düşünüldü. Özellikle K2'nin sitotoksik etkilerine rağmen γ-globin gen ekspresyon düzeylerindeki ciddi artış, 4-fenilkumarin ve 3 fenilkumarinlerin farklı türevlerinde HbF indükleme çalışmalarına yol gösterici olabileceği düşünülmektedir.
G6PD aktivitesinin belirlenmesine yeni bakış: Seçici enzim biyosensörü
Glukoz-6-fosfat dehidrogenaz (G6PD) enzimi pentoz fosfat yolunun (PFY) ilk basamağını katalizleyen kilit bir enzimdir. Eritrositlerde NADPH oluşumu için tek kaynak PFY olup, G6PD eksikliğinde NADPH üretimi önemli ölçüde azalmaktadır. Günümüz mevcut G6PD enzim aktivite ölçüm yöntemleri enzim düzeyini sıfır olarak belirleyebilmektedir. Fakat "housekeeping" enzim olan G6PD enziminin aktivitesinin mutlak sıfır olması yaşamla bağdaşmamaktadır. Biz de bu durumu açıklığa kavuşturmak amacıyla tez çalışması kapsamında enzim düzeyini hassas olarak belirleyebilen seçici enzim biyosensörü sistemini tasarladık. Çalışma grubu G6PD enzim aktivitesi sıfır olarak ölçülen veya düşük olan olgulardan oluşmaktadır. Çalışmamızda 3'lü elektrot sistemi kullanıldı. Çalışma elektrodu olarak altın, karşıt elektrot olarak platin tel, referans elektrot olarak Ag/AgCl kullanıldı. Biyoaktif tabaka hem BSA/Jelatin hem de HEMA-MAC polimerleri ile oluşturuldu. Biyoaktif tabakanın SEM görüntüsü alındı ve FTIR analizi yapıldı. Glutatyon redüktaz enzimi G6PD enzim aktivitesi sonucu oluşan NADPH'leri substrat olarak kullanmak üzere altın elektroda immobilize edildi. Glutaraldehit ile çapraz bağlama gerçekleştirildi. Biyosensörde; biyoaktif tabakanın, immobilizasyon koşullarının ve enzimin çalışma koşullarının optimizasyonu yapıldı. NADPH'nin yükseltgenerek NADP oluştururken ortaya çıkan potansiyel fark biyosensörde Diferansiyel Puls Voltametri (DPV) ile ölçüldü. Standart grafik kullanılarak G6PD enzim düzeyinin hassas ölçümü yapıldı. Tasarladığımız seçici enzim biyosensörü sistemi ile geleneksel yöntemlerle sıfır olarak ölçülen olguların G6PD enzim aktivite düzeylerinin gerçek değerlerine ulaşıldı. G6PD enzim aktivitesinin mutlak sıfır olmadığı elde edilen DPV ölçümleri sonucu ortaya kondu. Böylelikle dünyada en sık rastlanan enzimopati olan G6PD'nin enzim aktivitesi biyosensör sistemi kullanarak daha duyarlı bir biçimde ölçüldü. Tasarlanan bu seçici enzim biyosensörünün eritrosit G6PD enzim eksikliği olan olguların teşhis ve izlemlerine önemli katkıda bulunacağı öngörülmektedir.
Çukurova bölgesinde gama globin ekspresyonu değişimine neden olan SNP'lerin hemoglobinopati kliniğine etkisinin incelenmesi
β-talasemiler β-globin zincirlerini kodlayan genlerde mutasyonlar veya delesyonlar ile karakterize, Orak hücre anemisi ise β-globin zincirinin 6. pozisyonunda tek bir aminoasidin yer değiştirmesi (β 6Glu→Val) sonucu HbS olarak isimlendirilen orak şeklindeki hemoglobin üretimiyle karakterize genetik hastalıklardır. Son yıllarda kompleks hastalıklarda bireylerin ilaçlara yanıtlarındaki genetik çeşitliliğin belirlenmesinde, hastanın genotipine göre bireysel tedavi seçeneklerinin geliştirilmesi ve yeni terapötik hedeflerin belirlenmesinde tekli gen polimorfizmleri (SNP'ler) artan bir ilgiyle kullanılmaktadır. β-talasemi ve orak hücreli anemi (HbS) gibi hemoglobinopatilerde Fetal Hemoglobin (HbF) düzeyi değişik miktarlarda yükselir. Erişkin dönemde HbF'in değişen düzeylerde devam etmesi genetik faktörlerle kontrol edilir. Bu faktörler arasında HBG2 lokusunda Xmn1 (C→T), SNP'si ve kromozom 2 üzerindeki BCL11A, kromozom 6 üzerindeki HMIP SNP'lerini içeren QTL (Quantitative Trait Loci)'ler yer almaktadır. Çalışmamızda Pediatrik Hematoloji Anabilim Dalı'na başvuran 90 β-talasemi ve 10 orak hücre anemili toplam 100 hastada HbF sentezini arttırarak fenotipi iyileştiren rs7482144 (Xmn1), rs11886868 (BCL11A) ve rs9399137 (HMIP) SNP'leri tetra-primer ARMS ve RT-PCR yöntemleri kullanılarak değerlendirilmiştir. Hastalar Xmn1 polimorfizminde sırasıyla %74 "C/C", %26 "C/T" allellerini, BCL11A polimorfizminde 54'ü "C/C", 30'u "C/T" ve 16'sı "T/T" allelerini ve HMIP polimorfizminde hastaların %100'ünün "T/T" alleli taşıdıkları saptanmıştır. Hastalarda taranan üç SNP'nin allel frekansları incelenmiş olup Xmn1 "C", BCL11A "C" ve HMIP "T" allelleri majör alleler olarak saptanmışlardır. Xmn1, BCL11A ve HMIP polimorfizmleri birlikte incelendiğinde Xmn1 "C/T", BCL11A "T/T" ve HMIP "T/T" allellerini birlikte taşıyan bireylerde HbF sentezinin yüksek oranda (p<0,01) olduğu saptanmıştır.
Çukurova Bölgesinde β -talasemi majörlü hastalarda HbF düzeyine etki eden SNP'lerin hemoglobinopati kliniğine etkisinin incelenmesi
Hemoglobinopati, otozomal resesif geçişli monogenik bozuklukların en sık görülen grubudur. Hemoglobin (Hb) molekülünün alfa (α) ve beta (β) globin zincirlerini kodlayan genlerde mutasyon veya delesyonlar ile karakterizedir. Ülkemizde en sık görülen kalıtsal kan hastalıkları arasında yer almakta olup özellikle güney ve batı bölgelerinde önemli bir sağlık sorunudur. Yapılan çalışmalarda Çukurova Bölgesi'nde talasemi taşıyıcılığının görülme sıklığının %3, orak hücreli anemi (HbS) görülme sıklığının %10 gibi çok yüksek oranlarda olduğu bilinmektedir. Son yıllarda kompleks hastalıklarda bireylerin ilaçlara yanıtlarındaki genetik çeşitliliğin belirlenmesinde, hastanın genotipine göre bireysel tedavi seçeneklerinin geliştirilmesi ve yeni terapötik hedeflerin belirlenmesinde tek nükleotid polimorfizmleri (SNP'ler) artan bir ilgiyle kullanılmaktadır. β-talasemi ve OHA gibi hemoglobinopatilerde Fetal hemoglobin (HbF) düzeyi değişik miktarlarda yükselir. Erişkin dönemde HbF'nin değişen düzeyleri genetik faktörlerle kontrol edilir. Bu faktörler arasında HBG2 lokusunda SNP'si ve kromozom 2 üzerindeki BCL11A, kromozom 6 üzerindeki HMIP SNP'lerini içeren QTL (Quantitative Trait Loci)'ler yer almaktadır. Bu SNP'ler birlikte, HbF düzeylerindeki değişimin yaklaşık yarısını oluşturur. Çalışmamızda Pediatrik Hematoloji Anabilim Dalı'na başvuran 90 β-talasemi ve 10 orak hücre anemili toplam 100 hastada HbF sentezini arttırarak fenotipi iyileştiren, rs1427407 (BCL11A) ve rs9399137 (HMIP) SNP'leri RT-PCR yöntemleri kullanılarak değerlendirilmiştir. Hastalar rs1427407 polimorfizminde sırasıyla %51"C/C", %21"C/T" ve 28"T/T" allellerini ve rs9399137 polimorfizminde hastaların %100'ünün "T/T" alleli taşıdıkları saptanmıştır. Hastalarda taranan iki SNP'nin allel frekansları incelenmiş olup rs1427407 "C", ve rs9399137 "T" allelleri majör alleler olarak saptanmışlardır. rs1427407 ve rs9399137 polimorfizmleri birlikte incelendiğinde rs1427407 "C/T", ve rs9399137 "T/T" allellerini birlikte taşıyan bireylerde HbF sentezinin yüksek oranda (p<0,01) olduğu saptanmıştır. "C/T" genotipli β-talasemili hastalarda rs1427407 polimorfizminin HbF düzeylerini OHA'lı bireylere göre daha fazla etkilediği bulundu (p<0.001).
Kronik böbrek hastalığında prokalsitonin değerleri ve yeni eşik değer belirlenmesi
Amaç: Enfeksiyon bulgusu olmayan kronik böbrek hastalığı (KBH) bulunan hastalar ile yaş ve cinsiyet bakımında eşitlenmiş sağlıklı kontroller arasında Prokalsitonin (PCT), C-reaktif protein (CRP) ve beyaz kan hücreleri (WBC; White Blood Cell) düzeylerinin retrospektif olarak karşılaştırılması amaçlanmıştır. Buna ek olarak, son dönem KBH hastalarında PCT'nin enfeksiyon belirteci olarak güvenilirliğini artırmak ve gereksiz antibiyotik kullanımını önlemek amacıyla klinik olarak daha doğru bir eşik değer düzeyinin belirlenmesi hedeflenmiştir. Gereç ve Yöntem: Bu çalışmada, 100 sağlıklı birey ve 100'er kişiden oluşan Evre 1-2, Evre 3, Evre 4 ve Evre 5 KBH hastaları arasında PCT, CRP ve WBC seviyeleri retrospektif olarak karşılaştırılmıştır. Ayrıca, enfeksiyonu bulunan ve bulunmayan 100'er Evre 5 KBH hastası prospektif olarak değerlendirilmiş, ELISA yöntemi ile PCT düzeyleri ölçülmüş ve Evre 5 hastaları için optimal eşik değerin belirlenmesi amacıyla ROC eğrisi analizi gerçekleştirilmiştir. Bulgular: Retrospektif çalışmada, sağlıklı bireyler ve farklı evrelerdeki KBH hastalarının yaş ortalamaları arasında anlamlı bir fark olup olmadığını değerlendirmek amacıyla Tek Yönlü Varyans Analizi yapılmış olup, gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark bulunmamıştır (p = 0,474). eGFR (tahmini glomerüler filtrasyon hızı), PCT, CRP ve WBC değerleri için yapılan Kruskal-Wallis testi, tüm parametrelerde gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar olduğunu göstermiştir (p <0,001). Bonferroni düzeltmesi yapılmış Mann-Whitney U testi sonuçlarına göre, eGFR tüm gruplar arasında anlamlı farklılık göstermiştir (p <0,001). PCT düzeyleri açısından yapılan ikili karşılaştırmalarda, sağlıklı bireyler ile Evre 1-2 KBH hastaları arasında anlamlı bir fark bulunmazken (p = 0,999), Evre 1-2 ile Evre 3 arasında anlamlı bir fark gözlenmiştir (p = 0,030). PCT seviyeleri, Evre 3'ten itibaren belirgin şekilde artış göstermiş olup Evre 4 (p = 0,001) ile Evre 5'te (p = 0,010) istatistiksel olarak anlamlı düzeyde yükselmiştir. CRP düzeylerinde, sağlıklı bireyler ile Evre 1-2 ve Evre 3 KBH hastaları arasında anlamlı bir fark saptanmamış (p = 0,999), ancak Evre 4 ile sağlıklı bireyler ve Evre 1-2 arasında anlamlı bir artış gözlemlenmiştir (p = 0,004). Evre 5 ile Evre 4 arasında anlamlı bir fark bulunmamasına rağmen (p = 0,100), Evre 5'te CRP düzeylerinin önceki evrelere göre belirgin şekilde arttığı tespit edilmiştir. WBC düzeyleri açısından yapılan analizlerde, sağlıklı bireyler ile Evre 1-2, Evre 3 ve Evre 4 KBH hastaları arasında anlamlı bir fark saptanmamıştır (p >0,05). Ancak, Evre 5'te WBC seviyeleri sağlıklı bireyler ve erken evre KBH hastalarına kıyasla anlamlı düzeyde azalmıştır (p <0,05). Tüm gruplar için yapılan Spearman korelasyon analizi sonuçlarına göre, eGFR ile PCT (r = −0,697; p <0,001) ve eGFR ile CRP (r = −0,314; p <0,001) arasında güçlü negatif korelasyon, eGFR ile WBC arasında ise pozitif korelasyon (r = 0,206; p <0,001) tespit edilmiştir. Grupların kendi içinde yapılan analizlerde ise sağlıklı bireylerde eGFR ile PCT, CRP veya WBC arasında anlamlı bir korelasyon saptanmamıştır (p >0,05). Evre 1-2 KBH hastalarında eGFR ile WBC arasında negatif (r = −0,240; p = 0,016), Evre 3 KBH hastalarında ise eGFR ile PCT arasında negatif korelasyon gözlenmiştir (r = −0,251, p = 0,012). Evre 4 ve Evre 5 KBH hastalarında eGFR ile PCT, CRP ve WBC arasında anlamlı bir korelasyon bulunmamıştır (p >0,05). Prospektif çalışmamızda, yapılan Ki-kare testi ve T testi sonuçlarına göre, enfeksiyonu bulunan ve bulunmayan Evre 5 KBH hastaları arasında yaş ve cinsiyet açısından anlamlı bir fark saptanmamıştır (p = 0,777, p = 0,220). İki grup arasında yapılan Mann-Whitney U testi sonuçlarına göre, eGFR düzeyleri açısından anlamlı bir fark saptanmamıştır (p = 0,190). Buna karşın, PCT seviyeleri açısından gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı bir farklılık bulunmuştur (p <0,001). Evre 5 KBH hastalarında yapılan ROC analizi, enfeksiyonu ayırt etmek için optimal PCT eşik değerini 0,74 ng/mL olarak belirlemiştir. Bu kesim noktasında, testin duyarlılığı ve özgüllüğü %90, pozitif ve negatif prediktif değerleri ise %90 olarak hesaplanmıştır. Eğri altında kalan alan (AUC) 0,953 olup, PCT'nin enfeksiyon belirlemede yüksek tanısal doğruluğa sahip olduğunu göstermektedir. Sonuç: Bu çalışma, PCT ve CRP'nin KBH'nin ilerleyen evrelerinde anlamlı şekilde arttığını, WBC'nin ileri evrelerde azaldığını ve eGFR'nin evre ilerledikçe kademeli olarak düştüğünü göstermektedir. Özellikle PCT seviyelerinin, enfeksiyon varlığı ve böbrek fonksiyon kaybı ile ilişkili olarak belirgin artış gösterdiği tespit edilmiştir. Çalışmamızdaki ROC analizi sonuçları, klinik pratikte enfeksiyonun erken teşhisi ve yönetimi için PCT seviyeleri açısından daha yüksek bir eşik değerin (0,74 ng/mL) dikkate alınması gerektiğini ortaya koymaktadır.
Apoptozis belirtecinin belirlenmesinde biyosensör geliştirilmesi
Apoptoz gelişim ve doku homeostazında kritik rol oynayan temel bir fizyolojik süreçtir. Bu süreç, belirli koşullar altında bir dizi sinyal dizisi tarafından düzenlenir. Kaspaz kaskat sistemi, hücre içi apoptotik sinyallerin indüksiyonunda, transdüksiyonunda ve amplifikasyonunda hayati rol oynar. Bir sistein-aspartik asit proteazı olan kaspaz-3 küçük hücreli olmayan akciğer kanserinde, hepatoselüler karsinomda, intraserebral kanamalarda, akciğer adenokarsinomunda, şiddetli seyreden endometriyozis vakalarında, mesane karsinomunda kötü prognozla ilişkilendirilmiştir. Bu nedenle, Kaspaz-3'ün saptanması, apoptoz görüntüleme, erken tümör tedavisi ve diğer hastalıkların izlem etkisinin değerlendirilmesi için büyük önem taşımaktadır. Elektrokimyasal immünosensörler aktif tabaka yüzeyinde immobilize edilmiş antikor ve özgün antijen arasındaki etkileşimlere dayanan bir tür afinite biyosensörüdür. Bu tez çalışmasında kaspaz-3'ün nicel ölçümü için elektrokimyasal immünosensör tasarımı ve bu biyosensöre ait karakterizasyon ile optimizasyon çalışmaları yapılarak elde edilen sonuçların ELISA yöntemiyle karşılaştırılması amaçlanmıştır. Tez çalışmasının ilk aşamasında altın elektrot yüzeyi antikaspaz-3 ile kaplandı ve tepkime ortamındaki kaspaz-3 ile etkileşimi sonucu oluşturduğu akım farkından yararlanıldı. Biyoaktif tabakanın optimizasyonunda kitosan, aljinat, jelatin ve BSA'nın farklı kombinasyonları kullanılarak immobilizasyon jelleri hazırlandı. SEM mikrograflarında ve FTIR spektrumlarında optimum immobilizasyon polimerkombinasyonu Aljinat-Jelatin'de elde edilmiştir. AFM analizinden elde edilen yüzey görüntüleri SEM ve FTIR sonuçlarını desteklemektedir. Optimum çapraz bağlayıcı EDC/NHS (0,3 M:0,1 M) olup çalışma ortamı pH'si 6,5, 0,1 M asetat tamponunda optimum sonuçlar elde edilmiştir. Tasarladığımız kaspaz-3 biyosensörünün doğrusal saptama aralığı 1.5 100 ng/mL, tekrarlanabilirlik çalışmasında elde edilen ortalama değer (x̄)=10,02, standart sapma değeri (SD)=0,18 varyasyon katsayısı (CV)= %1,8'dir. Günler arası tekrarlanabilirlik çalışmasından elde edilen standart sapma değeri 2,5'dir. Elektrodun raf ömrü ise %40 aktivite kaybının görüldüğü 30. güne kadar kullanılabilir olduğu belirlendi. ELISA yöntemi ve tasarlanan biyosensör verilerinin karşılaştırılması sonucu elde edilen korelasyon katsayısı 0,9927 olup bu değer tasarlanan kaspaz-3 biyosensörünün pratikte kullanımı için uygun olduğunu göstermektedir.