Theses supervised by Prof. Dr. Özen Özensoy Güler
17 theses · Ankara Yıldırım Beyazıt University
Benzotiyazol grubu içeren sülfonamidlerin tümör ilişkili karbonik anhidraz IX XII(CA-IX, CA-XII) izoenzimleri ve sitozolik karbonik anhidraz I, II (CA-I, CA-II) izoenzimleri üzerine spesifik inhibisyon etkilerinin incelenmesi
Karbonik anhidrazlar (CA, EC 4.2.1.1) metabolize dokular ve akciğerler arasında CO2 /HCO3- transport ve respirasyonu, pH ve CO2 homeostazisi, çeşitli doku ve organlarda elektrolit sekresyonu, biyosentetik reaksiyonlar (glukoneogenez, lipogenez, ürogenez vb.), kemik yıkımı, kalsifikasyon, tümör gelişimi gibi pek çok fizyolojik ve patolojik süreçte görev alırlar. CA-I ve CA-II memeli kırmızı kan hücrelerinde bulunan iki ana sitozolik CA izoformudur. CA-IX ve CA-XII ise tümör ilişkili-CA izoenzimleridir ve bu izoenzimler ekstrasellüler asidifikasyonu tetikleyerek tümör gelişimine katkıda bulunurlar. Araştırmamızda yeni sentezlenmiş olan benzotiyazol grubu içeren 14 adet sekonder sülfonamid türevi CA inhibitörünün, CA-I, CA-II, CA-IX, CA-XII üzerine olan inhibisyon etkileri incelenmiştir. İnhibisyon çalışmaları SX.18MV-R Applied Photophysics Stopped-Flow Kinetik aleti ile yapılmıştır. CA-I ve CA-II için en etkin inhibisyonu gösteren bileşik AnA14 bileşiği olarak tespit edilmiştir. AnA14 bileşiğinin inhibisyon değerleri CA-I ve CA-II için sırasıyla 8,11 ve 0,19 μM olarak bulunmuştur. Diğer inhibitörler ise CA-IX ve CA-XII izoenzimleri üzerinde CA-I ve CA-II'ye göre daha etkili bir inhibisyon etkisi göstermiştir.
Yeni sentezlenmiş kromon temelli sülfonamidlerin (KTS) sitozolik karbonik anhidraz I-II (CA I-II) ve tümör ilişkili karbonik anhidraz IX-XII (CA IX-XII) izoenzimleri üzerine inhibisyon etkilerinin araştırılması
Karbonik anhidraz (CA, EC. 4. 2. 1. 1) enzimi, karbondioksit/bikarbonat'ın hidratasyon/dehidratasyonunu geri dönüşümlü olarak katalize eden, çinko iyonu içeren metalloenzimlerden biridir. Sitozolik CA izoenzimlerinden CA I, eritrositlerde en bol miktarda bulunan enzim iken, diğer bir sitozolik izoenzim olan CA II çoğu organda yüksek eksprese olup birçok önemli fizyolojik sürece katkı sağlar. Tümör ilişkili izoenzimler CA IX ve CA XII ise hipoksi ile indüklenen, kanser süreci ile ilişkili olan ve birçok tümörde yüksek eksprese edilen tümör ilişkili proteinlerdir.Bu çalışmada on iki adet yeni sentezlenmiş kromon temelli sülfonamid (KTS) türevi bileşiklerin CA-I, CA-II, CA-IX ve CA-XII izoenzimleri üzerine inhibisyon etkisi in vitro olarak incelemiştir. CA aktivitesinin belirlenmesinde hidrataz aktivitesi kullanılmış ve Stopped flow kinetik cihazı ile ölçüm yapılmıştır. Yeni sentezlenmiş kromon temelli sülfonamidler ile yapılan inhibisyon çalışmalarına göre, tümör ilişkili CA-IX için 7a ve 11a bileşikleri, tümör ilişkili CA-XII için ise 4a ve 10a bileşikleri en etkin bileşikler olmuştur. CA-IX için kinetik değerler, 7a ve 11a bileşikleri için sırasıyla Ki= 14.26 nM ve Ki= 18.39 nM'dır. CA-XII için kinetik değerler, 4a ve 10a bileşikleri için sırasıyla Ki= 4.54 nM ve Ki= 5.23 nM'dır. Kromon temelli sülfonamid türevi olan söz konusu bu bileşiklerin tümör ilişkili CA-IX ve CA-XII izoenzimlerine karşı seçicilik gösterdiği tespit edilmiştir. Seçicilik gösteren bu bileşiklerin bazı klinik uygulamalarda tedavilere yeni yaklaşımlar getirebilecekleri düşünülmektedir.
Akciğer kanserli hastalarda kanda dolaşan tümör hücrelerinin akım sitometrisi ile tespiti
Dolaşımdaki tümör hücreleri (CTC'ler) karsinomların metastatik yayılımında önemli role sahiptir. Bu nedenle, son yıllarda birçok kanser türünde hastalığın seyri ve tedavi etkinliğini anlaşılmasında yardımcı olabileceği düşünülen CTC'ler üzerine yoğunlaşılmıştır. Teknik yaklaşımlardaki gelişmeler ile özellikle akciğer kanseri gibi dokularına ulaşılması zor olan tümörlerde sıvı biyopsi olarak tüm kandan CTC tespitinin değeri her geçen gün artmaktadır. Tanı anında sıklıkla metastaz yaptıkları teşhis edilen akciğer kanseri, hem kadınlarda hem de erkeklerde kanser ölüm nedenlerinin birincil sebebidir. Çalışmamızın amacı modifiye ettiğimiz metot ile akciğer kanserli hastaların periferik kan örneklerinde (7.5 mL) CTC tespitidir. CTC sayısının tespit edilmesi için 9 akciğer kanserli birey ve 9 sağlıklı birey çalışmaya dahil edilmiştir. Uyguladığımız metotta CTC zenginleştirilmesi için fikol yoğunluk gradiyent ayrımı ve manyetik mikro-boncuklar yardımı ile CD45 negatif seçilim gerçekleştirilmiştir. Son olarak, CTC'ler epitelyal adezyon molekülü (EpCAM) ve sitokeratin (CK 7,8,14,15,16,19) ekspresyolarının hedef alınması ile çoklu parametreli olarak akım sitometrisi ile analiz edilmiştir. Çalışmamız sonucunda akciğer kanserli hastaların tümünde CTC gözlenirken, sağlıklı bireylerde gözlenmemiştir (Z=3.823; p<0.001). Böylece, modifiye ettiğimiz metodun akciğer kanserinde CTC tespitinde kullanılabilirliği gösterilmiştir.
Kanda dolaşan tümör hücrelerinin kolorektal kanserli (CRC) hastalarda akım sitometrisi ile tespiti
Kolorektal kanser (CRC), dünyadaki ölümlerin önde gelen nedenlerinden biridir. CRC gibi katı tümörlü hastalarda kansere bağlı ölüm nedenleri arasında metastatik CRC en sık rastlanan formdur. Metastaz, kanser hastalarının periferik kanlarındaki dolaşımdaki tümör hücrelerinin (CTC) varlığı ile ilişkilidir. Çalışmamızda, CTC zenginleştirme ve saptama stratejileri için modifiye edilmiş uygun yöntemle kolorektal kanser hastalarının kan örneklerinde CTC'ler tespit edildi. İlk önce 7.5 mL periferik kan numuneleri toplandı ve periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC'ler) taze kan numunelerinden fikol gradyanı ayrımı ile izole edildi. Daha sonra, PBMC'lerdeki lökositler, negatif bir seçim için CD45 ile konjuge edilmiş manyetik mikro boncukları ile uzaklaştırıldı. Son olarak, elde edilen hücreler anti-epitelyal hücre adhezyon molekülü (anti-EpCAM), sitokeratinler (CK8, CK19 ve anti-CD45 olarak lökosit-spesifik işaretleyici) ile etiketlendi. Tüm numuneler BD FACS Aria III akış sitometrisi ile analiz edildi. 10 kolorektal kanseri hastası ve 7 sağlıklı birey ile çalışılmıştır. Çalışmamızda, CK19 tabanlı kapılama stratejisi ile kolorektal kanseri hastaların kan örneklerinde 2-13 CTC tespit edilirken, sağlıklı bireylerin kan örneklerinde CTC'lerin saptanmadığı gözlenmiştir. Kanser hastalarının kan örneklerinden CTC saptanmasının, hastalık durumunun gerçek zamanlı izlenmesi ve kişisel terapi geliştirilmesi için bir tümör biyolojik belirteci olabileceği düşünülmektedir.
Hepatosellüler karsinoma hücre hattında Rosmarinus officinalis bitki ekstraktının PON 1 ve CA-IX enzim aktiviteleri üzerine etkisinin incelenmesi
ÖZET Hepatosellüler Karsinoma Hücre Hattında Rosmarinus Officinalis Bitki Ekstraktının Pon1 ve CA-IX Enzim Aktiviteleri Üzerine Etkisinin İncelenmesi Hepatoselüler karsinom (HCC), dünyada kansere bağlı ölümlerin önde gelen nedenlerinden biridir. Karbonik anhidraz enzim ailesi (CA; EC 4.2.1.1), karbondioksitin (CO2) hidratasyonunu katalize ederek bikarbonat (HCO3-) ve hidrojen iyonları (H+) üreten çinko (Zn+2) bağımlı metalloenzimlerdir. CA-IX, tümör mikroçevresinin pH'ını arttıran CA ailesine ait hücre yüzey glikoproteinidir. Yapılan çalışmalarda, hipoksik ortamda hepatosellüler karsinom hücrelerinde CA-IX ekspresyonun yüksek olduğu ve metastaz ile ilişkili olduğu bildirilmiştir. Paraoksonaz (PON; EC 3.1.8.1) enzimi paraoksonu hidrolize ederek zararlı etkilerini ortadan kaldıran kalsiyum bağımlı hidrolitik serum metaloenzimdir. PON enzim ailesi, düşük oksidatif stres, kanserli hastalarda inflamasyon ve hücre ölümünün düzenlenmesinde önemli role sahiptir. PON1, tümör hücrelerinde redoks sistemin düzenlenmesini sağlayan PON ailesine ait hücre yüzey glikoproteinidir. PON1'in ekspresyonunun hepatosellüler karsinomda azalarak inflamasyon ve oksidatif stresle ilişkili olduğu bilinmektedir. Çalışmamızda bitki türleri arasında Ballıbabagiller (Lamiaceae) familyasına ait Rosmarinus officinalis (Biberiye) türünden elde edilen fenolik bileşiklerin ve çeşitli ekstraktlarının hepatosellüler karsinoma hücre hattında (HepG2) farklı konsantrasyonlarda R. officinalis bitki ekstraktı uygulanarak sitotoksik etkileri incelenecektir. R. Officinalis bitki ekstraktının PON1 enzimi ve tümör ilişkili CA-IX enzim ilişkisi araştırılarak tıp ve eczacılık alanında anti-inflamasyon, anti-kanser ve antioksidan etkisi bilinen halk dilinde biberiye bitkisi olarak adlandırılan Rosmarinus officinalis'ın HepG2 üzerindeki etkisinin enzim düzeylerine olan etkisinin gösterilmesi amaçlanmıştır. Çalışmamızda, R.Officinalis metanol ve etanol bitki ekstraktlarının CA-IX ve PON1 enzimleri düzeyinde HCC hücreleri üzerinde antiproliferatif etki gösterdiği saptanmıştır.
Hepatoselüler karsinom (HEPG2 hücre hattı) üzerinde borik asit uygulamasının glutatyon peroksidaz enzim aktivitesi üzerine etkisi
Hepatoselüler Karsinom (HepG2 Hücre Hattı) Üzerinde Borik Asit Uygulamasının Glutatyon Peroksidaz Enzim Aktivitesi Üzerine Etkisi Hepatoselüler Karsinom, çoğunlukla karaciğer hastalığı olan ve siroz gelişen hastalarda ortaya çıkan en yaygın primer karaciğer malignitesidir. Sitokrom P-450 (CYP450); ilaç, ksenobiyotikler, kolesterol ve safra asidi sentezinde, streoid sentezi ve katabolizmasında rol oynayan enzim sistemidir. CYP450 enziminin, artan aktivitesinin lipit peroksidasyonuna ve ROS üretimine yol açtığı bilinmektedir. Glutatyon Peroksidaz enzimi (GPx) hücrelerin sitoplazmasında bulunup H2O2'den kaynaklanan oksidatif hasara karşı hücreleri koruyan antioksidan enzimdir. GPx enziminin, anjiyogenez ve tümör hücrelerinin proliferasyonunu inhibe ettiği bildirilmiştir. Ayrıca GPx enziminin, immün aracılı mekanizmalarla hepatoselüler karsinom oluşumunu önlediği ve ilerlemesini baskıladığı da bilinmektedir. GPx enziminin inhibisyonunun hücrede programlanmış ölüme neden olduğu bildirilmiştir. Bor elementi vücuda su ve bitki kaynaklı besinlerden alınır, gastrointestinal sistemde neredeyse tamamen emilir ve kanda borik asit olarak dolaşır. Çalışmalarda borik asitin, uygulanan doz ile bağlantılı olarak bazı kanser türlerinde, proliferasyonu inhibe ederek apoptozu indüklediğini göstermiştir. Bu çalışmada, HepG2 hücre hattında borik asitin GPx aktivitesi üzerindeki etkisi in vitro olarak araştırılmıştır. GPx aktivitesi spektrofotometrik olarak ölçülmüştür. Borik asitin GPx enzimi üzerine inhibisyon etkisi gözlendiği tespit edilmiştir. Borik asitin GPx enzimi üzerine sitotoksitesini belirlemek için hücre canlılık testi uygulanarak inhibisyon seviyeleri ölçülmüştür. Bu çalışmada, GraphPad Prism 9 programı kullanılarak, HepG2 hücreleri üzerine uygulanacak borik asit dozu 236,7 mM olarak belirlenmiştir ayrıca borik asit uygulanan ve uygulanmayan HepG2 hücrelerinde GPx konsantrasyonlarının anlamlılık düzeyleri gösterilmiştir. Sonuç olarak, borik asit hepatoselüler karsinom hücreleri üzerinde glutatyon peroksidaz enzim aktivite düzeyinde anlamlı inhibisyon etkisi göstermiştir. Anahtar Kelimeler: Borik Asit, Glutatyon Peroksidaz, Hepatoselüler Karsinom
Normoksik ve hipoksik koşullarda hepatosellüler karsinom hücrelerinde ve eksozomlarında paraoksonaz enzim ailesi ile PI3K/AKT sinyal yolağı ilişkisinin incelenmesi
Hepatoselüler karsinom (HCC), hipoksik tümör mikroçevresi ve oksidatif stres ile karakterize edilen, kansere bağlı ölümlerin önde gelen nedenlerinden biridir. Enzimatik bir antioksidan olan paraoksonazın (PON) (EC 3.1.1.2), hücreleri oksidatif stresten koruyarak, apoptozun engellenmesi ve kanser hücresinin sağkalımında rol oynadığı düşünülmektedir. ROS detoksifikasyonunda, redoks homeostazında ve PON düzenlenmesinde Fosfatidilinositol-3-kinaz (PI3K)/Akt sinyal yolağı etkilidir. Sinyal iletimine aracılık eden eksozomlar karsinogenez süreciyle de yakından ilişkilidir. Non-invaziv olarak elde edilen eksozom içeriklerinin, erken tarama, erken tanı, terapötik etkilerin izlenmesi ve ilaç direncinin saptanmasında kullanılabilirliği son yıllarda dikkat çekmektedir. Hipoksi ve oksidatif stres koşullarında, eksozom salınımı artmakta ve eksozom içeriği değişmektedir. Çalışmamızın amacı, normoksik ve hipoksik koşullarda hepatosellüler karsinom hücre hattında (HepG2) ve eksozomlarında, PON enzim ailesi ile PI3K/Akt sinyal yolağı proteinlerinin ilişkisini belirlemektir. Çalışmamızda, MACS sistemiyle HepG2 hücre hattı eksozomları izole edilerek Bradford, SEM ve NTA yöntemleriyle karakterize edilmiştir. HepG2 hücre hattı için uygun hipoksi maruziyet süresinin belirlenmesi adına farklı hipoksik zaman dilimlerinde (2, 4, 6, 12 ve 24 saatler) HIF-1α protein seviyeleri western blot ve ELISA kullanılarak tespit edilmiştir. Hem normoksik hem de uygun süredeki hipoksik koşullarda çoğaltılan HepG2 hücre hattından hücre ve eksozom lizatları elde edilmiştir. Paraoksonaz ve laktonaz enzim aktiviteleri spektrofotometrik olarak tayin edilmiştir. Ayrıca PON enzim ailesi (PON1, PON2, PON3) ve PI3K/Akt sinyal yolağı proteinleri (Akt, p-Akt, mTOR, p-mTOR) western blot ile analiz edilmiştir. Çalışmamız sonucunda HepG2 hücre hattı için uygun hipoksi maruziyet süresi 4 saat olarak belirlenmiştir. Söz konusu HepG2 hücre hattından eksozomlar başarılı bir şekilde izole edilmiştir. Normoksik koşullara kıyasla hipoksik koşullarda, PON enzim ailesi (PON1, PON2, PON3) protein düzeylerinde anlamlı bir artış olmasına rağmen, paraoksonaz ve laktonaz enzim aktivitelerinde azalma tespit edilmiştir (p˂0.05). Hipoksik koşullar; Akt, p-Akt, mTOR ve p-mTOR düzeylerinde, HepG2 hücrelerinde artışa sebep olurken, eksozomlarında azalmaya sebep olmuştur. Bu sonuçlara göre; hipoksik koşullarda PON enzim aktivite azalmasının HCC'nin karsinogenez sürecine katkı sağladığı gösterilmiştir. PON enzimlerinin ekspresyon artışının da onkogen gibi davranarak PI3K/Akt sinyal yolağının aktifleşmesinde rol oynadığı düşünülmektedir. PI3K/Akt ve PON arasındaki bu ilişkide eksozomların da rol oynadığı tespit edilmiştir. Anahtar Kelimeler: Eksozom, Hepatosellüler karsinom, Hipoksi, Paraoksonaz, PI3K/Akt sinyal yolağı.
Melanom hücre hatlarında borik asit uygulamasının tirozinaz enzim aktivitesi üzerine etkisinin incelenmesi
Malign melanom; cilt, göz ve saç rengini belirleyen nöral krest kökenli melanin üreten melanosit hücrelerinin malign tümörü olup görülme sıklığı hızla artış gösteren ve mortalitesi yüksek olan bir kanser türüdür. Tirozinaz enzimi (EC.1.14.18.1) melanositlerde melanin oluşumundan sorumlu enzim olup melanom kanserinde aktivitesinin arttığı gösterilmiştir. Tirozinaz enzimi yıllardır melanom teşhisinde biyobelirteç olarak kullanılmaktadır. Tirozinaz enziminin inhibitörlerinin melanom hücrelerindeki tirozinaz enzim aktivitesini inhibe etmesiyle hücrelerin apoptoz yolağına girdiğinin anlaşılması melanom tedavisinde son derece önemli bir yaklaşımı beraberinde getirmiştir. Borik asidin (BA, H3BO3) kanser hücre hatlarında oksidatif strese, hücre büyümesinin inhibisyonuna, apoptoza ve hücre morfolojisinde değişikliklere neden olduğu bilinmektedir. Bu çalışmanın amacı, SK-MELL-30 ve WM115 melanom hücre hatlarında BA'nın, tirozinaz enzim aktivitesi üzerindeki etkisinin araştırılmasıdır. Söz konusu çalışmamızda SK-MELL-30 ve WM115 hücre hatlarına 2,5-250 mM arasında 6 farklı konsantrasyonda borik asit uygulanmıştır. L-DOPA tirozinaz enziminin substratı olarak kullanılmıştır. Tirozinaz enzim aktivitesi 475 nm dalga boyunda spektrofotometrik olarak tespit edilmiştir. BA uygulaması tirozinaz enziminin bilinen en iyi inhibitörü Kojik asit (KA) ile karşılaştırma yapıldığında ise, WM115 hücre hattında anlamlı bir inhibisyon göstermiştir (p=0,046) SK-MELL-30 hücre hattında ise anlamlı bir sonuç elde edilememiştir (p=0,085). BA kullanımının tirozinaz enzimi üzerindeki inhibisyon mekanizmalarını geniş çapta aydınlatmak için analitik yöntemlerin kullanılması ve mekanizmaların açıklığa kavuşturulması bir sonraki deneysel çalışmalarımızın hedefini oluşturmuştur. Anahtar kelimeler: Borik Asit, Kanser, Melanom, Tirozinaz
Paraoksonaz-1 (PON1) enziminin kolon kanseri hücrelerinde mapk sinyal yolağı üzerindeki etkisinin araştırılması
Kolon kanseri ile rektum kanserleri kolorektal kanser adı altında birlikte gruplandırılır. Dünyada ve Türkiye'de en yaygın beş kanser türü arasında yer alan kolorektal kanserler gastrointestinal sistemin en yaygın kötü huylu tümörüdür. Kanser oluşumunda ROS'ların etkisi günümüzde açık bir şekilde bilinmektedir. ROS'lar yalnızca karsinogenezin başlamasında değil; ilerlemesinde de rol alır. PON enzim ailesi antioksidan özellikleri sayesinde endojen serbest radikal temizleyici sistemin bir parçasıdır. Bu özellikleri ile birçok kanserin etiyolojisi ve önlenmesinde rol aldıkları ileri sürülmektedir. Diğer taraftan insan tümörlerinin yaklaşık üçte birinde MAPK sinyal yolağının aşırı aktivasyonu söz konusudur. Bu bilgiler ışığında, çalışmamızda kolon kanserinde PON1 enzimi ile MAPK sinyal yolağı arasındaki etkileşimin incelenmesi amaçlanmıştır. Çalışmamızda HT-29 kolon kanseri hücre hattı ile CCD-18Co sağlıklı kolon hücre hattı kullanılmıştır. PON1 enzim aktiviteleri spektrofotometrik olarak tayin edilmiştir. PON1 düzeyleri ile MAPK sinyal yolağında görevli B-Raf, p-B-Raf, ERK ve p-ERK protein düzeyleri Western Blot yöntemi ile analiz edilmiştir. Çalışmamızda kolon kanseri hücrelerinde, sağlıklı hücrelere kıyasla PON1 düzeyi ile PON1 enzim aktivitesinin azaldığı görülmüştür (sırasıyla p=0.0173, p=0.0281). Ayrıca kolon kanseri hücrelerinde MAPK sinyal yolağında görevli p-B-Raf ve p-ERK protein düzeylerinin arttığı tespit edilmiştir (sırasıyla p=0.0037, p=0.0074). Sonuçlarımıza göre PON1 düzeyi ile PON1 enzim aktivitesi arasında pozitif yönlü korelasyon tespit edilmiştir (p=0.008). Ek olarak, PON1 düzeyi ile MAPK sinyal yolağının aktivasyonunda rol alan p-B-Raf ve p-ERK protein düzeyleri arasında negatif yönlü korelasyon tespit edilmiştir (sırasıyla p=0.016, p=0.036). Ayrıca PON1 enzim aktivitesi ile p-B-Raf ve p-ERK protein düzeyleri arasında da negatif yönlü korelasyon tespit edilmiştir (sırasıyla p=0.060, p=0.037). Kanser hücrelerinde MAPK yolağında tespit edilen aktivite artışına; PON1 düzeyi ile PON1 enzim aktivitesindeki azalmanın sebep olduğu düşünülmektedir.
Melanom hücre hatlarında Lactarius deliciosus mantar ekstraktının CA-IX enzim aktivitesi üzerine etkisinin incelenmesi
Karbonik anhidraz enzim ailesi (EC 4.2.1.1), CO2 hidrasyonunu katalize ederek HCO3- ve H+ üreten Zn+2 bağımlı metalloenzimlerdir. CA enzim ailesi, metabolizma ve tümör oluşumu için anahtar role sahiptir. CA-IX, katı tümörlerin pH'sının düzenlenmesini sağlayan CA ailesine ait hücre yüzey glikoproteinidir. CA-IX kanserin metastazı, ilerlemesi ve terapötik yanıtı ile ilişkilidir. Melanom, epidermisteki melanin üreten melanosit hücrelerinin tümörleşmesi ile oluşan, mortalitesi yüksek kanser türüdür. CA-IX, melanomdaki asidik mikroçevre ile ilişkilidir. CA-IX enzim aktivitesi, tümör mikroçevresini daha hipoksik yapar. Hipoksik ortamda melanom hücre hatlarında CA-IX ekspresyonun daha yüksek olduğu bildirilmiştir. Lactarius deliciosus mantar türünün antioksidan ve antikanser etkisi gözlemlenmiştir. Bu çalışmanın amacı, melanom hücre hatlarında L.deliciosus mantar ekstraktının, CA-IX enzim düzeyi üzerine etkisinin araştırılmasıdır. Bu çalışmada, L. deliciosus mantarının ekstraktı hazırlanmıştır. Kontrol grubu için CA-IX'un bilinen inhibitörü asetazolamid kullanılmıştır.L. deliciosus mantar ekstraktı ile Asetazolamidin(AZA) WM115 (primer) ve SK-MEL-30 (metastatik) hücre hatlarındaki sitotoksik etkileri, WST-1 yöntemi kullanılarak değerlendirilmiş ve IC50 değerleri hesaplanmıştır. AZA ve mantar ekstraktının CA-IX enzim düzeyi üzerine etkileri Enzim Bağlı İmmünosorbent Analizi (ELISA) testi ile değerlendirilmiştir. WM115 hücre hattında AZA ve L. deliciosus mantar ekstraktı için IC50 değerleri sırasıyla 21,41 μmol/L ve 275 μg/ml olarak belirlenmiştir. SK-MEL-30 hücrelerinde IC50 değerleri sırasıyla 12,98 μmol/L ve 276,45 μg/ml'dir. AZA uygulanması, CA-IX enzim düzeyi üzerine anlamlı bir inhibisyon etkisi göstermiştir. L. deliciosus mantar ekstraktının CA-IX enzim düzeyini anlamlı bir şekilde artırdığı SK-MEL-30 ve WM115 melanom hücre hatlarında tespit edilmiştir (p<0,0001).
Melanom hücre hattında Karbonik Anhidraz-IX inhibisyonunun B-RAF proteini üzerine etkilerinin araştırılması
Melanomda önemli bir biyolojik belirteç olan CA-IX, tümör hücrelerinde yüksek derecede eksprese olan ve inhibisyonu yoğun şekilde çalışılan önemli bir enzimdir. Bu transmembran yapıdaki enzimin IC kuyrukları aracılığıyla karsinogenezde rolleri olan bazı yolakları etkilediği keşfedilmiştir. Hücre dışı sinyallerden hücre içi yanıtlara geçişte önemli olan ve birçok hücresel işlevi düzenleyen MAPK yolağı tümör oluşumu ile de ilişkilidir. CA-IX'un ekspresyonunun, MAPK yolağının bileşenleri tarafından düzenlendiği bilinmektedir. Bu yolağın mutasyona uğramış BRAFV600E tarafından aktivasyonu melanom büyümesini, hayatta kalmasını ve anjiyogenezi uyarır. CA-IX inhibisyonunun MAPK yolağı üzerindeki etkisi bugüne kadar aydınlatılmamıştır. Bu tez çalışmasında, CA-IX proteininin inhibisyonunun, MAPK yolağında yer alan B-Raf proteini üzerine olan etkisinin araştırılması amaçlanmıştır. Söz konusu çalışmada, AZA ve VMF inhibitörleri BRAFV600E mutasyonu olan A375 melanom hücrelerine uygulanmıştır. Hücre proliferasyonu WST-1 deneyi ile belirlenmiştir. Bu hücrelerde CA9 ve HIF1A ekspresyonları qRT-PCR yöntemi ile araştırılmıştır. CA-IX protein düzeyine AZA inhibitör uygulamasının etkisi ELISA testi ile gösterilmiştir. HIF-1α, CA-IX, B-Raf ve ERK proteinlerinin lokalizasyonları ve ekspresyonları, AZA uygulanmış ve uygulanmamış melanom hücrelerinde immünofloresan boyama ile incelenmiştir. Ayrıca Western Blot analizi ile HIF-1α, B-Raf, p-B-Raf, ERK ve p-ERK proteinleri değerlendirilmiştir. Bu tez çalışmasında, AZA ile CA-IX inhibisyonunun p-B-Raf ve p-ERK protein düzeylerinde azalmaya sebep olduğu gösterilmiştir. Bu sonuçlara göre; AZA uygulamasının MAPK yolağındaki B-Raf proteini üzerine olan inhibisyon etkisi, CA inhibitörlerini bu yolak için potansiyel bir ajan olarak düşündürmektedir.
Kolon kanser hücre hattında karbonik anhidraz ıx inhibisyonunun EZH2 geni ve histon 3 modifikasyonlar üzerine etkisinin incelenmesi
Kolorektal kanser, yüksek morbidite ve mortalite oranları ile dünya çapında en sık görülen gastrointestinal kanserlerden biridir. Kolorektal kanser malign forma dönüştükçe çeşitli genetik ve moleküler değişiklikler meydana gelmektedir. Anormal metillenmiş genler, DNA anormallikleri ve CpG adacık metilasyon fenotipi gibi genomik ve histon modifikasyonları, gibi epigenomik değişiklikler görülmektedir. Tümör hücreleri değişen mikro ortamın gereksinimlerine uyacak şekilde düzenlemeler gerçekleştirir. Tümörlerin ortak özelliği olan hipoksinin neden olduğu asidozda, CO2/bikarbonat transportu, pH, CO2, hemeostasiz, tümörleşme gibi birçok fizyolojik olayın karbonik anhidraz enzim ailesi (CA, EC 4.2.1.1) tarafından katalizlendiği bilinmektedir. Çalışmamızda kullanılan tümör ilişkili CA IX enziminin ekspresyonu farklı karsinom tipleri ile yakından ilişkili olduğundan ve hipoksik ortamda indüklendiğinden, hipoksinin bir belirteci ve prognostik göstergesi olarak gösterilir. Araştırmamızın temel hedefi, kolon kanseri HT-29 hücre hattında tümör ilişkili CA IX enzim inhibisyonunun CO2/HCO3¯ tampon sisteminde H+ iyon derişim etkisinin hücre epigenetik modifikasyonlar üzerindeki etkileşim mekanizmasının aydınlatılmasıdır. Çalışmamızda, CA IX enzim inhibisyon sonucu ortam asidifikasyonun azalması ile birlikte HIF1α ekspresyonunun azaldığı tespit edilmiştir (p<0.01). Bu durum ile bağlantılı EZH2 gen ekspresyonunun da artması (p<0.05) son derece önemlidir. Normoksik koşullarda CA IX enzim inhibisyonu sonrası HT-29 Histon 3 metilasyonunda artış hipoksik koşullarda histon metilasyonunda azalmayı indüklemiştir. Ayrıca, CA IX enzim inhibisyonu normoksik koşullarda HT- 29 hücre hattında asetilasyon seviyelerinde artışı indüklerken hipoksik koşullarda bu durum asetilasyon seviyelerini azaltmıştır.
Renal kanser hücre hattında (CAKI-2) karbonik Anhidraz-IX enzim inhibisyonunun mTOR proteini üzerine etkilerinin araştırılması
Karbonik anhidraz (CA) karbondioksit/bikarbonatın'ın (CO2/HCO3-) dönüşümünü katalizler. CA enzim ailesi içerisinde tümörle ilişkisi gösterilen izoenzimlerden biri CA-IX'dur. CA-IX'un tümörlü dokularda ekspresyonu artmaktadır ayrıca intrasellüler kuyruklarının (IC) fosforillenmesinin kanser ile ilişkili olduğu bilinmektedir. PI3K/Akt/mTOR sinyal yolağı; hücre proliferasyonu, sağkalımı ve farklılaşmasında görevli bir sinyal iletim yoludur. Bu etkilerini S6K1 ve 4EBP1 proteinlerinin aktivasyonu aracılığıyla gösterir. mTOR'un aktivitesi kanser hücrelerinde yüksektir ve en yüksek ifade edildiği kanser türlerinden biri de renal kanserlerdir. Renal kanserlerin en yaygın histolojik tipi ise berrak hücreli renal karsinomdur. Bu çalışmada amaçlanan, CA-IX inhibisyonunun, tümorogenez sürecinde etkili olduğu bilinen mTOR yolağı üzerine olan etkisini belirlemektir. Bu amaçla çalışmada CAKI-2 insan berrak hücreli renal karsinoma hücre hattı kullanılmıştır. Çalışmada kullanılan inhibitörler olan Rapamisin ve Asetazolamid'in bu hücre hatları üzerindeki etkin dozunu belirlemek için WST-1 sitotoksisite testi yapılmıştır. Hipoksik ortam oluşuturulmuş ve kontrolü Real Time PCR ve Western Blot yöntemleri ile yapılmıştır. CA-IX inhibisyonunun mTOR yolağı üzerine olan etkisini belirlemek için Western blot ve immünofloresan boyama çalışmaları yapılmıştır. Çalışmanın sonucunda AZA'nın mTOR sinyal yolağında inhibisyon etkisine neden olduğu gösterilmiştir. Ancak bu etki istatistiksel olarak anlamsız bulunmuştur (p>0.05).Bu inhibisyon etkisinin gösterilmiş olması ileriki çalışmalar için öncü nitelik taşımaktadır. Elde edilen sonuçlar kanser tedavisinde kullanılacak yeni ilaç uygulamaları için son derece önemli bir katkı sağlayabilir.
Yeni sentezlenmiş kromon temelli sülfonamidlerin (KTS) sitozolik karbonik anhidraz I-II (CA I-II) ve tümör ilişkili karbonik anhidraz IX-XII (CA IX-XII) izoenzimleri üzerine inhibisyon etkilerinin araştırılması
Karbonik anhidraz (CA, EC. 4. 2. 1. 1) enzimi, karbondioksit/bikarbonat'ın hidratasyon/dehidratasyonunu geri dönüşümlü olarak katalize eden, çinko iyonu içeren metalloenzimlerden biridir. Sitozolik CA izoenzimlerinden CA I, eritrositlerde en bol miktarda bulunan enzim iken, diğer bir sitozolik izoenzim olan CA II çoğu organda yüksek eksprese olup birçok önemli fizyolojik sürece katkı sağlar. Tümör ilişkili izoenzimler CA IX ve CA XII ise hipoksi ile indüklenen, kanser süreci ile ilişkili olan ve birçok tümörde yüksek eksprese edilen tümör ilişkili proteinlerdir.Bu çalışmada on iki adet yeni sentezlenmiş kromon temelli sülfonamid (KTS) türevi bileşiklerin CA-I, CA-II, CA-IX ve CA-XII izoenzimleri üzerine inhibisyon etkisi in vitro olarak incelemiştir. CA aktivitesinin belirlenmesinde hidrataz aktivitesi kullanılmış ve Stopped flow kinetik cihazı ile ölçüm yapılmıştır. Yeni sentezlenmiş kromon temelli sülfonamidler ile yapılan inhibisyon çalışmalarına göre, tümör ilişkili CA-IX için 7a ve 11a bileşikleri, tümör ilişkili CA-XII için ise 4a ve 10a bileşikleri en etkin bileşikler olmuştur. CA-IX için kinetik değerler, 7a ve 11a bileşikleri için sırasıyla Ki= 14.26 nM ve Ki= 18.39 nM'dır. CA-XII için kinetik değerler, 4a ve 10a bileşikleri için sırasıyla Ki= 4.54 nM ve Ki= 5.23 nM'dır. Kromon temelli sülfonamid türevi olan söz konusu bu bileşiklerin tümör ilişkili CA-IX ve CA-XII izoenzimlerine karşı seçicilik gösterdiği tespit edilmiştir. Seçicilik gösteren bu bileşiklerin bazı klinik uygulamalarda tedavilere yeni yaklaşımlar getirebilecekleri düşünülmektedir.
Benzotiyazol grubu içeren sülfonamidlerin tümör ilişkili karbonik anhidraz IX XII(CA-IX, CA-XII) izoenzimleri ve sitozolik karbonik anhidraz I, II (CA-I, CA-II) izoenzimleri üzerine spesifik inhibisyon etkilerinin incelenmesi
Karbonik anhidrazlar (CA, EC 4.2.1.1) metabolize dokular ve akciğerler arasında CO2 /HCO3- transport ve respirasyonu, pH ve CO2 homeostazisi, çeşitli doku ve organlarda elektrolit sekresyonu, biyosentetik reaksiyonlar (glukoneogenez, lipogenez, ürogenez vb.), kemik yıkımı, kalsifikasyon, tümör gelişimi gibi pek çok fizyolojik ve patolojik süreçte görev alırlar. CA-I ve CA-II memeli kırmızı kan hücrelerinde bulunan iki ana sitozolik CA izoformudur. CA-IX ve CA-XII ise tümör ilişkili-CA izoenzimleridir ve bu izoenzimler ekstrasellüler asidifikasyonu tetikleyerek tümör gelişimine katkıda bulunurlar. Araştırmamızda yeni sentezlenmiş olan benzotiyazol grubu içeren 14 adet sekonder sülfonamid türevi CA inhibitörünün, CA-I, CA-II, CA-IX, CA-XII üzerine olan inhibisyon etkileri incelenmiştir. İnhibisyon çalışmaları SX.18MV-R Applied Photophysics Stopped-Flow Kinetik aleti ile yapılmıştır. CA-I ve CA-II için en etkin inhibisyonu gösteren bileşik AnA14 bileşiği olarak tespit edilmiştir. AnA14 bileşiğinin inhibisyon değerleri CA-I ve CA-II için sırasıyla 8,11 ve 0,19 μM olarak bulunmuştur. Diğer inhibitörler ise CA-IX ve CA-XII izoenzimleri üzerinde CA-I ve CA-II'ye göre daha etkili bir inhibisyon etkisi göstermiştir.
Hidrosefali hastalığının tedavi sürecinde tümör ilişkili CA-VII, CA-IX VE CA-XII enzim düzeylerinin incelenmesi
Hidrosefali, beyin omurilik sıvısının (BOS) serebral ventriküller ve subaraknoid boşlukta anormal birikimi ile karakterize, tedavi edilmediği takdirde ciddi nörolojik komplikasyonlara yol açabilen bir hastalıktır. Hem konjenital (primer) hem de edinilmiş (sekonder) nedenlerle gelişebilir, genellikle tümör, enfeksiyon, prematürite veya travma gibi patolojilerle ilişkilidir. Bu çeşitlilik, hastalığın insidans ve komplikasyon oranlarının belirlenmesini zorlaştırmaktadır. BOS, merkezi sinir sistemi içinde dolaşarak, koruyucu bir etki gösterir, iyon dengesinin sağlanmasında ve beyin iç ortamının düzenlenmesinde önemli görevler üstlenir. BOS üretimi ve dolaşımı, çeşitli moleküler mekanizmalarla, özellikle karbonik anhidraz (CA) enzim ailesi tarafından kontrol edilmektedir. Beyin tümörlerine bağlı hidrosefali, genellikle tümörün BOS dolaşımını tıkaması veya BOS üretimini artırması sonucu gelişir. Bu süreçte, CO₂'nin MSS'den BOS'a transferi ve burada tamponlanması, pH homeostazı açısından kritik öneme sahiptir. Ancak, CO₂ ve karbonik anhidraz sisteminin hidrosefali ve tümör oluşumu üzerindeki etkileri tam olarak açıklığa kavuşmamıştır. Karbonik anhidrazlar, CO₂'nin hidrasyonunu katalizleyerek HCO₃⁻ ve H⁺ iyonlarının oluşumunu sağlar ve pH düzenlenmesi, metabolik süreçler, BOS üretimi ve tümör gelişiminde önemli roller üstlenir. Özellikle kanserle ilişkili izoformlar olan CA-VII, CA-IX ve CA-XII, moleküler düzeydeki patofizyolojinin anlaşılması açısından kritik öneme sahiptir. Bu çalışmanın amacı, hidrosefali tanısı almış çocuk ve erişkin hastalarda, tümörle ilişkili CA-VII, CA-IX ve CA-XII enzimlerinin aktivite düzeyleri ve protein ekspresyonlarını değerlendirmektir. Elde edilecek veriler, bu enzimlerin hidrosefali sürecine katkısını, BOS pH düzenlemesindeki rollerini ve patogeneze etkilerini detaylı şekilde analiz etmeyi hedeflemektedir. Bu çalışmada elde edilen bulgulara göre; çocuk ve yetişkin grupları arasında BOS'taki CA-VII (p=0,023) ve CA-XII (p=0,047) düzeyleri anlamlı şekilde farklılık göstermiş, çocuklarda bu enzim düzeyleri daha yüksek bulunmuştur. Serum düzeylerinde ise yalnızca CA-IX enzimi anlamlı fark göstermiş (p=0,000) ve yetişkinlerde çocuklara kıyasla belirgin şekilde daha yüksek saptanmıştır. Ayrıca, çocuk grubunda BOS ve serum CA-XII düzeyleri arasında güçlü ve anlamlı pozitif bir korelasyon (r=0,794, p=0,001) bulunmuştur. Cinsiyete ve yetişkinlerdeki BOS-serum ilişkisine dair karşılaştırmalarda ise istatistiksel olarak anlamlı fark saptanmamıştır. Çalışma, hidrosefali oluşum mekanizmalarının daha iyi anlaşılmasına katkı sağlamayı ve bu enzimleri potansiyel tanısal ve tedavi edici hedefler olarak değerlendirmeyi amaçlamaktadır.
Hidrosefali hastalığının tedavi sürecinde tümör ilişkili CA-VII, CA-IX VE CA-XII enzim düzeylerinin incelenmesi
Hidrosefali, beyin omurilik sıvısının (BOS) serebral ventriküller ve subaraknoid boşlukta anormal birikimi ile karakterize, tedavi edilmediği takdirde ciddi nörolojik komplikasyonlara yol açabilen bir hastalıktır. Hem konjenital (primer) hem de edinilmiş (sekonder) nedenlerle gelişebilir, genellikle tümör, enfeksiyon, prematürite veya travma gibi patolojilerle ilişkilidir. Bu çeşitlilik, hastalığın insidans ve komplikasyon oranlarının belirlenmesini zorlaştırmaktadır. BOS, merkezi sinir sistemi içinde dolaşarak, koruyucu bir etki gösterir, iyon dengesinin sağlanmasında ve beyin iç ortamının düzenlenmesinde önemli görevler üstlenir. BOS üretimi ve dolaşımı, çeşitli moleküler mekanizmalarla, özellikle karbonik anhidraz (CA) enzim ailesi tarafından kontrol edilmektedir. Beyin tümörlerine bağlı hidrosefali, genellikle tümörün BOS dolaşımını tıkaması veya BOS üretimini artırması sonucu gelişir. Bu süreçte, CO₂'nin MSS'den BOS'a transferi ve burada tamponlanması, pH homeostazı açısından kritik öneme sahiptir. Ancak, CO₂ ve karbonik anhidraz sisteminin hidrosefali ve tümör oluşumu üzerindeki etkileri tam olarak açıklığa kavuşmamıştır. Karbonik anhidrazlar, CO₂'nin hidrasyonunu katalizleyerek HCO₃⁻ ve H⁺ iyonlarının oluşumunu sağlar ve pH düzenlenmesi, metabolik süreçler, BOS üretimi ve tümör gelişiminde önemli roller üstlenir. Özellikle kanserle ilişkili izoformlar olan CA-VII, CA-IX ve CA-XII, moleküler düzeydeki patofizyolojinin anlaşılması açısından kritik öneme sahiptir. Bu çalışmanın amacı, hidrosefali tanısı almış çocuk ve erişkin hastalarda, tümörle ilişkili CA-VII, CA-IX ve CA-XII enzimlerinin aktivite düzeyleri ve protein ekspresyonlarını değerlendirmektir. Elde edilecek veriler, bu enzimlerin hidrosefali sürecine katkısını, BOS pH düzenlemesindeki rollerini ve patogeneze etkilerini detaylı şekilde analiz etmeyi hedeflemektedir. Bu çalışmada elde edilen bulgulara göre; çocuk ve yetişkin grupları arasında BOS'taki CA-VII (p=0,023) ve CA-XII (p=0,047) düzeyleri anlamlı şekilde farklılık göstermiş, çocuklarda bu enzim düzeyleri daha yüksek bulunmuştur. Serum düzeylerinde ise yalnızca CA-IX enzimi anlamlı fark göstermiş (p=0,000) ve yetişkinlerde çocuklara kıyasla belirgin şekilde daha yüksek saptanmıştır. Ayrıca, çocuk grubunda BOS ve serum CA-XII düzeyleri arasında güçlü ve anlamlı pozitif bir korelasyon (r=0,794, p=0,001) bulunmuştur. Cinsiyete ve yetişkinlerdeki BOS-serum ilişkisine dair karşılaştırmalarda ise istatistiksel olarak anlamlı fark saptanmamıştır. Çalışma, hidrosefali oluşum mekanizmalarının daha iyi anlaşılmasına katkı sağlamayı ve bu enzimleri potansiyel tanısal ve tedavi edici hedefler olarak değerlendirmeyi amaçlamaktadır.