Ağız yıkama çözeltisindeki candida türlerinin belirlenmesi için multiplex PCR tanı kitlerinin geliştirilmesi

AMAÇ: Sağlıklı insanların ağız florasında maya mantarları da dahil olmak üzere birçok mikroorganizma denge ve uyum içerisinde bulunur. Bu denge halinin bozulması maya mantarlarının kolonizasyonuna veya ağız içi kandidoza sebep olabilir. Ağız boşluğunda sık görülen beş Candida türü (Candida albicans, Candida tropicalis, Candida krusei, Candida parapsilosis ve Candida dubliniensis) bilinmektedir. Candida türlerinin doğru belirlenmesi antifungal tedavi ve epidemiyolojik yönden çok önemlidir. Sunulan çalışmada, tıbbi önemi olan Candida türlerinin belirlenmesi ve tanımlanması için polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) temeline dayalı yeni bir Real-time PCR yönteminin geliştirilmesi amaçlanmıştır. GEREÇ VE YÖNTEM: Çukurova Üniversitesi Diş Hekimliği Fakültesinden yaşları 19–36 arasında olan 200 öğrenci bu çalışmaya katıldı. Gönüllü öğrencilerin her biri 15 ml distile su ile ağzını çalkaladı, örnekler 3000 rpm de 10 dakika santrifüj edildi. Çökelti 200 µL steril distile su içinde karıştırılarak CHROMAgar Candida besiyerine inoküle edildi. Genomik DNA izolasyonu Fungal Mini prep kiti ile yapıldı. İzolatların identifikasyonunda CHROMAgar Candida besiyeri, MALDI-TOF MS ve RT-PCR yöntemleri kullanıldı. Gen amplifikasyonu için iki çift spesifik primer kullanıldı. Analiz 7 farklı Candida referans suşunun ITS-2 dizileri üzerinden gerçekleştirildi. Sunulan çalışmada, Candida türlerini belirlemek için real-time polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) ve erime sıcaklığı analizi (MCA) ile çalışan yeni bir RT PCR-MCA yöntemi geliştirildi. BULGULAR: Toplam 52 (%26) klinik örnekten 71 maya izole edildi. Bu 71 maya mantarından 64'ü (%90.1) Candida spp. olup izole edilen türler, sıklığa göre, 22 C. albicans (%34.4), 16 C. parapsilosis (%25), 9 C. dubliniensis (%14.1), 6 C. lusitaniae (%9.4), 5 C. kefyr (%7.8), 2 C. lambica ve 4 (%6.9) diğer Candida türleri [1 C. krusei, 1 C. tropicalis, 1 C. inconspicua ve 1 C. pararugosa] idi. Toplam 64 Candida izolatına ilişkin MALDI-TOF MS verileri CAC ve iki ayrı RT-PCR sonuçları ile karşılaştırıldı. CAC besiyerinde 1 C. tropicalis kökeni yeşil koloni oluşturdu ve yanlış olarak C. albicans olarak identifiye edildi. RT-PCR yöntemi ile çalışmada izole edilen altı Candida türü MCA yöntemi ile tanımlandı, ancak iki tür, C. albicans ve C. kefyr, Tm sıcaklığına göre birbirinden ayırt edilemedi. Ayrıca, MALDI-TOF MS ile C. lambica olarak belirlenen iki izolat RT-PCR ile amplifiye edilemedi. TARTIŞMA: Candida türlerinin geleneksel yöntemler ile belirlenmesi ve birbirinden ayırt edilmesi 2–3 gün sürebilmektedir. Candida türlerinin bir gün içerisinde real-time PCR'ı takiben erime sıcaklığı (MCA) analizi basit, ucuz ve çabuk bir yöntemdir. Ancak, bu çalışmada Candida türlerinin kesin tanısı için yeterli olmadığı anlaşılmıştır. Anahtar kelimeler: Candida, chromogenic agar, identifikasyon, MALDI-TOF MS, PCR, Real-time PCR