Bacillus circulans ATCC 61'den α-amilazın klonlanması ve karakterizasyonu

En önemli enzim grubunu oluşturan amilazlar, biyoteknolojide de büyük önem kazanmaktadır. Mikroorganizmalardan elde edilen enzimler endüstriyel alanlarda yaygın bir şekilde kullanılır. Mevcut çalışmada Bacillus circulans ATCC 61 𝛼-amilaz üretimi için kullanılmıştır. Bakterinin 𝛼-amilaz üretmesi ve genom yapısı iyi bilindiğinden klonlama işlemi için kullanıldı. Bacillus circulans ATCC 61'in genomik DNA'sı izole edildi ve α-amilaz enzimini kodlayan amyE geni 1400 bç uzunluğundaki spesifik primerler kullanılarak PCR yöntemi ile çoğlatıldı. Bacillus α-amilaz'ına ait genler gen kütüphanesinde tarandıktan sonra uygun primer tasarlandı. PCR protokolünden sonra jelden saflaştırılan gen ürünleri 3015 bç uzunluğunda ve her iki 3' ucunda terminal timidin bulunan lineer pGEM®-T Easy vektörüne aktarıldı. İnsertisyon bölgesinde bulunan tek zincirli T kuyruklar, A-kuyruğuna sahip PCR ürünlerinin etkin bir şekilde ligasyonunu sağlar. Taq DNA polimeraz, PCR ürünlerinin sonuna bağımsız bir şekilde tek zincirli deoksiadenozinler sentezler. Klonlanan gene ait bioinformatik analizler, bu genin Bacillus sp. 𝛼-amilaz geni ile %100 oranında bir benzerliğe sahip olduğunu göstermiştir. Son olarak gen eksperesyonu için vektör, yüksek etkiye sahip JM109 E. coli competent hücrelerine transfer edildi. Bu çalışma Bacillus circulans ATCC 61'den α- amilaz enziminin klonlanması bakımından literatürdeki ilk kayıttır.