Köpeklerde luteolizisin moleküler mekanizmasının araştırılması

Gebe ve gebe olmayan köpeklerde luteal dönem hormonal mekanizması doğuma yakın prostaglandin F2 alfa (PGF2α) üretimi hariç benzerlik gösterir. Gebe köpeklerde uteroplasental bölgeden doğuma yakın korpus luteum (CL) yapısını lize eden PGF2α üretilmektedir. Ancak gebe olmayan köpeklerde PGF2α üretimi bulunmamakta, CL yavaş olarak regrese olmaktadır. Bu yavaş regresyon, köpeklerde luteal dönemde CL fonksiyonuna destek olan birçok luteotropik faktör bulunmasına rağmen gerçekleşmektedir. Bu yönleri ile köpeklerde luteolizis sürecindeki mekanizmalar hala tam olarak anlaşılamamıştır. Sunulan tezde amaç, gebe olmayan köpeklerde luteolizisin moleküler mekanizmasının araştırılmasıdır. Bu amaçla, gebe olmayan köpeklerde luteolizisi uyarmak için CL'nin PGF2α'ya duyarlı olduğu diöstrüsun 30-35. günlerinde deri altı olarak PGF2α, enjeksiyonları uygulandı. Gebe olmayan köpekler; kontrol grubu (n=4), 1 defa PGF2α uygulama grubu (1PGF, n=4), 2 defa PGF2α uygulama grubu (2PGF, n=4) ve 3 defa PGF2α uygulama grubu (3PGF, n=4) olmak üzere 4 gruba ayrıldı. Yüksek doz PGF2α'nin köpeklerdeki yan etkilerinden dolayı düşük doz (20 µg/kg) PGF2α uygulaması tercih edildi. Luteolizis sırasındaki moleküler değişimleri incelemek için, uygulama gruplarından son PGF2α enjeksiyonundan 1 saat sonra (1, 9 ve 25. saatlerde) ve kontrol grubundan (uygulama yok) CL örnekleri ovaryohisterektomi (OHE) operasyonu ile toplandı. Toplanan CL'lerden total RNA izole edilerek ters transkriptaz reaksiyonu ile komplementer DNA (cDNA) elde edildi. Luteolitik mekanizmada rol oynadığı bilinen genlerin (Steroidogenik akut regulatör protein (StAR), Kolesterol yan zincir bölünme enzimi (P450scc/CYP11A1), Lüteinleştirici hormon reseptörü (LH-R), Monosit kemoatraktan protein 1 (MCP-1), İnterlökin 8 (İL-8), Nukleer reseptör alt aile 4 grup A eleman 1 (NR4A1/Nurr77), Siklooksijenaz 1 ve 2 (COX-1, COX-2), Prostaglandin transporter (PGT), Prostaglandin F2α reseptörü (PGFR), BAX, Caspase-3, Fas-Ligand (Fas-L)) mRNA ekspresyonları Real-Time Polimeraz Zincir Reaksiyonu (Real-Time PZR) ile değerlendirildi. Luteal dokuda NR4A1 ve MCP-1'in mRNA düzeyinin hücresel lokalizasyonu, ile StAR'ın protein düzeyinin hücresel lokalizasyonu ve yoğunluğu sırasıyla İn situ hibridizasyon (İSH) ve immunohistokimya (İHK) metotları ile belirlendi. Prostaglandin F2α uyarımı sonrası NR4A1'in mRNA ekspresyon değerinin tedavi gruplarında daha yüksek olduğu, İSH yönteminde de luteal ve endoteliyal hücrelerde lokalize olduğu gözlemlendi. PGF2α enjeksiyon sayısı arttıkça PGFR, PGT ve COX-2'nin mRNA düzeyinin azaldığı tespit edildi. Siklooksijenaz 1'in ekspresyonunun gruplar arasında değişmediği gözlemlendi. İmmun yanıt ile ilgili MCP-1 ve İL-8 genlerinin mRNA ekspresyonlarında ilk enjeksiyon sonrası (1PGF) belirgin düzeyde artış olduğu saptandı. İn situ hibridizasyon ile PGF2α sonrası MCP-1'in luteal dokuda luteal ve endoteliyal hücreler aralarında lokalize olduğu gösterildi. Fas-L'nin mRNA ekspresyon değerinin sadece 3PGF grubunda yüksek olduğu belirlendi. Progesteron (P4) sentezinden sorumlu genler LH-R, StAR ve CYP11A1'in mRNA ekspresyonlarının PGF2α enjeksiyonları sonrası azaldığı tespit edildi. PGF2α enjeksiyon sayısı artışına bağlı StAR proteininin yoğunluğunun azalması İHK ile mikroskop altında görüntülendi. Apoptozis ile ilgili BAX ve Caspase-3 genlerinin mRNA ekspresyon değerleri gruplar arasında benzer bulundu. Serum P4 düzeyinin uygulama gruplarında PGF2α enjeksiyonları sonrası belirgin bir şekilde düştüğü ancak, çalışmanın sonunda hala bazal seviyenin üstünde olduğu belirlendi. Sonuçlara göre (serum P4 ve çalışılan genlerin mRNA ve protein (StAR) ekspresyon seviyeleri) gebe olmayan köpeklerde diöstrüsun 30-35. günlerinde tekrarlayan PGF2α enjeksiyonlarının CL'de fonksiyonel luteolizisi uyardığı düşünülmektedir. Uyarılmış luteolizis modelinde tekrarlayan PGF2α uygulamaları sonrası, PGF2α üretimi, etkisi ve taşınması ile P4 üretimi ve devamlılığından sorumlu mekanizmaların CL'de mRNA seviyesinde düştüğü tespit edildi. Ayrıca, LH-R'nin PGF2α uygulamaları ile azalması, ekzojen PGF2α uygulamalarının köpek CL'sinde luteotropik etkiyi engellediğini işaret etmektedir. Bununla birlikte, immun yanıt genlerinin ekspresyonunun PGF2α enjeksiyonu sonrası artması, köpek CL'sinde akut yangıyı uyardığını göstermektedir. Bu deneysel koşullar altında, apoptozis ile ilişkili genlerin PGF2α enjeksiyonlarına duyarsızlığı, PGF2α'nın fonksiyonel luteolizisi uyardığı fakat apoptozisi başlatmadığı şeklinde yorumlanabilir. Sonuç olarak, ekzojen tekrarlayan PGF2α uygulamaları ile gebe olmayan köpek CL'lerinde luteolitik mekanizmanın uyarılabildiği belirlenmiştir. Ayrıca, gebe olmayan köpek CL'lerindeki luteolizisin moleküler mekanizmasının, diğer evcil hayvan türleri ile bazı yönlerden benzerlik gösterdiği kanatine varıldı.