Theses supervised by Prof. Dr. Bülent Bozdoğan
11 theses · Aydın Adnan Menderes University
Romatoid artrit oluşum mekanizmasında yer alan PAD4 enzimini inhibe eden rekombinant peptidlerin geliştirilmesi
Amaç: Romatoid artrit patogenezinden sorumlu peptidil arjinin deiminaz 4 enziminin aktivitesini azaltmaya yönelik değişken ağır zincir (VH; variable heavy chain) yapıda rekombinant inhibitor geliştirmektir. Gereç ve Yöntem: PAD4 geninin E. coli'ye göre kodon optimizasyonu yapıldı ve sentezlettirildi. Sentezlenen PAD4 geni pET-30a vektörüne klonlandı ve E. coli BL21 (DE3)'e aktarıldı, PAD4 proteininin rekombinant üretimi gerçekleştirildi ve IMAC ile saflaştırıldı. Saflaştırılan PAD4 ile CD-1 fareler immunize edildi. İmmünize fare dalakları alındı ve total RNA izolasyonu yapıldı. Ardından, cDNA sentezi ve VH amplifikasyonu gerçekleştirildi. VH amplikonları çalışmada konstrüksiyonu gerçekleştirilen pComb3-hy vektörüne klonlandı ve E. coli XL1-Blue'ya aktarılarak VH kütüphanesi oluşturuldu. VH kütüphanesini içeren bakteri kültürü M13K07 fajı ile enfekte edildi ve VH gösteren faj kütüphanesi elde edildi. VH kütüphanesinden PAD4'e afinite gösteren VH gösteren fajlar panning ile seçildi. Afinite gösteren VH'ın sekans analizi yapıldı. Elde edilen VH4'ün amino asit sekansı kullanılarak üç boyutlu yapısı belirlendi ve PAD4 ile etkileşimini araştırmak için Alphafold ile modelleme yapıldı. VH4'ün PAD4'ün sitrülinleme aktivitesinin inhibisyonu floresans tabanlı izleme ile in-vitro olarak test edildi. VH4'ün PAD4'ün sitrülinleme aktivitesinin inhibisyonunun HeLa memeli hücre hattına morfolojik etkisi üzerinden değerlendirildi. VH4'ün sitotoksisite deneyi HeLa hücreleri ile WST-1 kullanılarak yapıldı. Bulgular: Çalışmada, koloni PCR ve sekans analizi sonucunda PAD4'ün klonlandığı doğrulandı. SDS-PAGE analizinde 75 kDa civarı bant eldesi neticesinde rekombinant PAD4 üretimi ve saflaştırılması doğrulandı. PAD4'e karşı oluşturulan VH gösterimi yapan faj kütüphanesinden PAD4'e afinite gösteren bir fajın kodladığı VH sekansı belirlendi. VH4 adı verilen bu peptidin moleküler ağırlığının 13 kDa ve in-silico olarak PAD4 ile 6 tane hidrojen bağı oluşturduğu gösterildi. In-vitro deneylerde VH4'ün PAD4 aktivitesini %30 azalttığı ve memeli hücre hattıyla yapılan in-vitro deneylerde PAD4 kaynaklı morfolojik bozukluğu önlediği ve sitotoksik etkiye sebep olmadığı gösterildi. Sonuç: Bu çalışmada sitrülinleme aktivitesi ile romatoid artritin patogenezinde önemli bir role sahip olan PAD4 enzimine karşı VH yapıda rekombinant inhibitor geliştirildi. Bu inhibitörün amino asit sekansı, üç boyutlu yapısı ve PAD4 ile etkileşimi gösterildi. Rekombinant PAD4 inhibitörü VH4'ün romatoid artrit tedavisinde kullanılma potansilyelinin belirlenmesi için hayvan modellerinde etkinliğinin test edilmesi dahil ileri çalışmalara ihtiyaç duyulmaktadır. Anahtar Kelimeler: romatoid artrit, peptidil arjinin deiminaz (PAD), faj gösterim tekniği, rekombinant peptid
Development of recombinant antibiotics against Enterococcus faecium
Purpose: It was aimed to develop a recombinant antibiotic originating from the VH sequence of antibodies obtained from PBP5-immunized mice Materials and Methods: The gene encoding soluble PBP5 was cloned into the pET-30a(+) vector, produced recombinantly, and purified by IMAC. CD-1 mice were immunized with sol-PBP5, and the immune response was confirmed by ELISA. RNA from immunized mice spleens was used for cDNA synthesis and VH amplification. A VH-displaying phage library was created by cloning VH amplicons into pComb3-hy phagemid. Phages binding to sol-PBP5 were selected via biopanning, and their VH sequences were identified. The 3D structure of VH43 and its interaction with sol-PBP5 were modeled, and VH43 was produced recombinantly. Binding tests were performed with BOCILLIN-FL. Synergistic effects of VH43 with cephalosporin were tested using bacterial growth analysis and modified Kirby-Bauer/spot tests. Results: Cloning of sol-PBP5 into the pET-30a(+) vector was confirmed by sequence analysis. Expression and purification were validated via SDS-PAGE, with BOCILLIN-FL treatment confirming the protein's native conformation. Immunization was confirmed by ELISA (p-value = 9.02e-05). cDNA from total RNA of immunized mice spleens showed 500-600 bp bands on agarose gel. VH amplicons were cloned into the phagemid, and a phage library was produced via M13K07 infection. Affinity phages for sol-PBP5 were selected by biopanning, and VH sequences were determined after the third biopanning cycle. VH43's amino acid sequence and CDRs were identified, with a molecular weight of 10.3 kDa, 12 alpha helices, and 61 beta chains. Seven hydrogen bonds were found between VH43 and sol-PBP5. Recombinant VH43, confirmed via SDS-PAGE to be 20.3 kDa including His-tags, showed reduced brightness in BOCILLIN FL binding experiments. Combining VH43 with cephalosporin significantly inhibited bacterial growth, with increased zone diameter in modified Kirby-Bauer tests compared to cephalosporin alone. Conclusion: The increase in antibiotic-resistant E. faecium strains requires the development of new molecules. VH43 discovered in this thesis study is the first antibody/antibody fragment developed against E. faecium and whose sequence was determined. Combining recombinant VH43 with cephalosporin showed synergetic effect and significantly inhibited bacterial growth. This result underscores the potential of VH43 to enhance the effectiveness of cephalosporins that are normally ineffective, offering a promising approach for combating bacterial infections.
pRTA, yeni bir vektör ve TA klonlama: Bilinmeyen antibiyotik direnç genlerinin karakterizasyonu için yöntem
Antibiyotikler en yaygın kullanılan ilaçlar arasındadır. Enfeksiyonların tedavisinde kullanıldığı gibi besi hayvanları ve bitkilerin büyümelerini hızlandırmak amacı ile de kullanılmaktadır. Genellikle vücuttan atıldıktan sonra da aktif halde kalan antibiyotiklerin bilinçsiz kullanımı antibiyotik direncinin gelişmesinde önemli bir faktördür. Son yıllarda çoklu antibiyotik direncine sahip suşların görülme sıklığı ve yaygınlığı artmaktadır. Antibiyotik direncine sebep olan genlerin karakterizasyonu direnç sorununun ortaya konması ve mücadele yollarının belirlenebilmesi açısından önemlidir. Bu çalışmanın temel amacı antibiyotik direncine neden olan bilinen veya bilinmeyen genlerin klonlanmasına imkan veren bir yöntem geliştirmektir. Bu amaçla, antibiyotik direnç genlerinin klonlanmasında oryantasyon sorunu yaşanmaması için çoklu klonlama bölgesinin her iki yönünden de ekspresyon sağlanabileceği vektör geliştirilmesi hedeflenmiştir. Oluşturulan pRTA vektörünün omurgası pUC19 vektöründen faydalanılarak invers PCR yoluyla elde edilmiştir. Dizayn edilen promotör ve RBS sekansı, vektör omurgasında hedeflenen lokasyona yerleştirilmiştir. Dual promotöre sahip vektörde promotör ve RBS'nin yerleşmesi ve fonksiyon gördüğünün belirlenmesi sekans analizi ve klonlama çalışmaları ile tespit edilmiştir. Geliştirilen klonlama yönteminde kullanılan 3'uçlarınında tek adenin bazı uzantısı bulunduran vektör, pRTA vektöründen PCR yoluyla elde edilen bir vektördür ve "AT vektörü" olarak adlandırılmıştır. Eritromisin direncine sahip S. aureus suşunun total DNA'sı fragmentaz enzimi ile rasgele parçalanıp istenen boyutlarda fragmentler oluşturulmuştur. Fragmentlerin 3' uçlarına AT vektörüne bağlanabilmesi için timin bazı eklendikten sonra fragmentler ve vektör ligasyonla bağlanmıştır. Oluşan ligand E. coli DH10B suşuna aktarılmış ve 200 μg/ml eritromisin içeren besi yerinde seçilmiştir. Çoğalan kolonilerdeki insertlerin sekans analizi yapıldığında direnç sağlayan genin ermC olduğu ve plazmid üzerinde taşındığı tespit edilmiştir. Sonuç olarak dual promotöre sahip ve mavi-beyaz seçilime imkan veren bir vektör geliştirilmiştir. Geliştirilen bu vektörden elde edilen AT vektörü plazmid izolasyonuna kıyasla daha verimli şekilde PCR yoluyla elde edilmiştir. Klonlanacak direnç genlerini içeren fragmanlar fragmentaz enzimi ile rasgele lokasyonlardan parçalanarak direnç geninin içinden kesilme ihtimalini düşürmüştür. Ayrıca direnç geninin klonlanabilecek boyutta fragmanlar oluşturmasını sağlayarak klonlama başarısını arttırmıştır. Bu tezde, yeni bir vektör ve bilinen ve bilinmeyen direnç genlerinin klonlanması için yeni bir yöntem geliştirilmiştir.
Çevresel örneklerden Escherichia coli DH10B suşuna karşı litik bakteriyofaj izolasyonu ve klinik Escherichia coli suşlarına karşı etkinliklerinin belirlenmesi
Doğada en fazla bulunan biyolojik topluluğu temsil eden bakteriyofajlar bakterileri enfekte eden virüsler olarak tanımlanmaktadırlar. Bakteriyofajların en iyi bilinen özelliklerinden biri tür spesifik olmalarıdır. Yeni antibiyotiklerin üretiminde yaşanan krizler ve Dünya genelinde artan antibiyotik kullanımından dolayı dirençli bakterilere karşı antibiyotik tedavisine alternatif bir yaklaşım arayışı gündeme gelmiştir. Buna paralel olarak, aslında 100 yıldır var olan bakteriyofajların tedavi amaçlı kullanımı (Faj Terapi) günümüzde tekrar bilim ve tıp dünyasının ilgi odağı haline gelmiştir. Dünya sağlık örgütü (DSÖ) tarafından günümüzde hastane ve toplum etkenli tedavisi zor enfeksiyon hastalıklarının en önemli etmenleri arasında patojenik Escherichia coli gösterilmektedir. Bu tez kapsamında; çevresel örneklerden E. coli DH10B suşuna etkili litik bakteriyofajların izolasyonu ve diyabetik ayak enfeksiyon (DAE) kökenli Escherichia coli izolatlarına karşı etkinliklerinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Çalışma kapsamında plak morfolojileri farklı 15 bakteriyofaj izole edilmiş ve restriksiyon endonükleaz profilleri belirlenmiştir. Kesilen 9 fajdan 4 farklı faj profili saptanmış ve kesilmeyen 6 faj arasında E. coli suşları üzerine etkilerine bakılarak 3 farklı faj biyotipi olduğu belirlenmiştir. Farklı profildeki fajlar KK1'den KK7'e kadar kodlanmış ve çalışmaya dâhil edilen 30 klinik izolata karşı etkinlikleri test edilmiştir. En yüksek litik aktiviteye sahip KK4 fajının izolatların 22'sine (%73) etkili olduğu ve tüm fajların karışımından hazırlanan kokteylin 3 izolat hariç tüm bakterilere etki ettiği belirlenmiştir (%90). İzole ettiğimiz fajlar da dahil olmak üzere fajların tedaviye yanıt vermeyen enfeksiyonlar için antibiyotiklerle birlikte kullanılabilme potansiyeli vardır. Özellikle klinik E. coli izolatlarının %73'üne etkili olduğu tespit edilen KK4 fajının bu amaçla kullanılma potansiyeli yüksektir.
Clostridium difficile toksin A geninin klonlanması
Son 20 yılda gerek hastane, gerekse toplum kaynaklı Clostridium difficile enfeksiyon insidans ve mortalitesinde belirgin bir artış görülmektedir. Hastalığın patogenezinden toksin A (enterotoksin) ve toksin B (sitotoksin) sorumludur. Ayrıca son yıllarda hastane salgınlarına neden olan binary toksin tanımlanmıştır. Bu çalışmada C. difficile toksin A geninin klonlanması ile toksin A elde edilerek tanı testlerinde kullanılabilecek antijen elde edilmesi amaçlanmıştır. Çalışmamızda, Türkiye Halk Sağlığı Kurumu (Ankara)'ndan temin edilen tcdA pozitif C. difficile 06012 suşu kullanılmıştır. Gen bankasından NCBI Reference Sequence: NC-009089.1 nolu tcdA sekansı baz alınarak spesifik primerler dizayn edilmiş ve primerler sonlarına BamHI restriksiyon enzim yeri eklenerek modifiye edilmiştir. C. difficile suşundan DNA saflaştırılmış ve PCR yoluyla ExTaq polimeraz enzimi yardımıyla tcdA genini içeren DNA fragmanıçoğaltılmıştır. Amplikon ve pUC19 plazmidi Bam HI enzimi ile kesilmiş ve ligasyondan sonra E. coli DH10B suşuna elektroporasyon yoluylaaktarılmıştır. Rekombinant plazmidler incelenmiş ve tcdA geni içeren plazmid seçilerek ileri araştırmalar için stoklanmıştır. Bu çalışmada C. difficile tcdA geni rekombinant toksin sentezi için klonlanmıştır. Toksin A'nın rekombinant teknoloji ile sentezlenmesi ve saflaştırılması daha ileri çalışmalar için kolaylık sağlayacaktır. Toksinin saflaştırılmasıyla poliklonal ve monoklonal antikorların eldesi, serum antikor düzeylerinin saptanması, enzim aktivitesi üzerine in vitro ve in vivo çalışmalar yapılabilmesi mümkün olacaktır.
Investigation of the effect of recombinant panton valentine lökosidin (PVL) toxin on prostate cancer cell line
Objective: The aim of this study is to generate the cytotoxic Panton-Valentine lökosidine (PVL) using recombinant technology and to examine its effect on the prostate cancer cell line. Materials and Methods: Primers to amplify LukS-PV and LukF-PV genes separately and together were designed according to genebank (NCBI CP084892), Amplified fragments were cloned into the pET30a(+) expression vector. Cloned fragments were confirmed by sequence analysis and used to obtain recombinant proteins. The synthesized proteins were purified partially and their effects on macrophages were investigated. Then, the cytotoxic effect of LukS and LukF seperatelly and together were tested on the normal prostate cell line (RWP-1) and prostate adenocarcinoma cell line (PC3). Cytotoxic effects were measured with the WST-1 test and the results were evaluated. Results: Recombinant LukS-PV and LukF-PV and in combination were obtained. Then, their effects on macrophages were examined, it was seen that rPVL and LukS-PV had cytotoxic effect on macrophage, but LukF-PV had no effect. When applied to prostate normal cell line (RWP-1) and adenocarcinoma cell line (PC3), the recombinant products obtained did not have any cytotoxic effect on either cell line. Conclusion: Although Panton Valentine Lökosidin had sitotoxic effect on macrophage cell line, no sitotoxic effect was observed on prostate normal cell line (RWP-1) and adenocarcinoma cell line (PC3).
Trichomonas vaginalis sialidaz geninin escherichia coli'de klonlanıp biyolojik aktivitesinin araştırılması
Amaç: Bu araştırma bir protozoon parazit olan T.vaginalis'in siyalidaz enzimini kodlayan geni klonlamak ve rekombinant organizmadan elde edilen ham ve saflaştırılmış siyalidaz enziminin biyolojik aktivitesini araştırmak amacıyla yapılmıştır. Gereç ve Yöntem: Araştırmada ADÜ Tıbbi Parazitoloji Anabilim Dalı'ndan temin edilen T. vaginalis parazitinin DNA'sı kullanılmıştır. PCR ile çoğaltılan siyalidaz geni, resktriksiyon ve ligasyon aşamalarından sonra, pET30a plazmidi üzerinde kimyasal transformasyon ile E.coli bakterisine aktarılmış ve üretilen siyalidaz proteini saflaştırılmıştır. Siyalidaz aktivitesi ham ve saflaştırılmış örneklerde, Nöraminidaz deney kiti ile araştırılmıştır. Bulgular: PCR ile çoğaltılan siyalidaz geninin büyüklüğü yaklaşık 1050 bp'dir. Sekans analizi sonucu amplikonun T. vaginalis G3 suşuna ait siyalidaz enzim geni ile % 99.69 oranında identiktir. pUC19 ve Pet30 plazmidleriyle yapılan transformasyon sonucu Sia32 olarak adlandırılan klon seçilmiş ve üretilen rekombinant proteinin molekül ağırlığı 44.5 kDa olarak hesaplanmıştır. Saflaştırma için yapılan optimizasyon denemelerinde en iyi metodun imidazolsüz başlangıç ve 25-200 mM lık imidazol elüsyon adımlarını içeren yöntem olduğu gösterilmiştir. Ham ve saflaştırılmış siyalidaz içeren örneklerde nöraminidaz deney kiti ile enzimin biyolojik aktivitesi doğrulanmış ve saf örneklerde enzim aktivitesinin daha düşük olduğu tespit edilmiştir. Sonuç: Bu çalışmada T. vaginalis parazitine ait siyalidaz geni klonlanarak saflaştırılmış ve biyokimyasal aktivitesi ticari deneme kiti ile doğrulanmıştır. Böylece, laboratuvarımızda rekombinant siyalidaz üreten E.coli BL21 suşu oluşturulmuştur. Rekombinant suş, siyalidaz enziminin diğer biyolojik özelliklerinin çalışılması ve siyalidaz inhibitörü geliştirmek için kaynak olacaktır.
Cloning and expression of potential vaccine candidates for Plasmodium falciparum
Introduction: Malaria remains a major global health burden, with Plasmodium falciparum responsible for the most severe and deadly cases. Despite current vaccine efforts, a fully protective and multistage vaccine remains elusive. This study focused on the cloning, expression, and evaluation of P. falciparum antigens as potential vaccine candidates targeting various life cycle stages of the parasite. Materials and Methods: Seven target genes encoding stage-specific antigens for circumsporozoite protein (CSP), thrombospondin-related ahesion protein (TRAP), apical membrane antigen (AMA-1), merozoite surface protein (MSP-1), falcipain (FAL), gametocyte surface protein (GSP) and transmission-blocking antigen (TBA) were synthetically constructed and codon-optimized for optimal expression in Escherichia coli. Signal peptide regions were removed to enhance expression efficiency and solubility. Four of the proteins namely AMA-1, MSP-1, FAL, and TBA were successfully expressed and purified. Cytotoxicity of the recombinant proteins was assessed using BJ human fibroblast cells treated with concentrations ranging from 1 to 200 μg/mL. Immunogenicity was evaluated in CD1 male mice assigned to groups of three, with each group receiving a mixture of adjuvant and a single or combination of the recombinant antigens, intramuscularly. The control group received an equivalent volume of adjuvant diluted in phosphate-buffered saline (PBS). The immunogenicity was then evaluated by indirect ELISA to measure antigen-specific antibody responses. Results: All four recombinant proteins exhibited successful expression and purification. ELISA results revealed that all proteins induced high antigen-specific antibody responses in immunized mice. Most importantly, the combination of antigens elicited higher antibody titers compared to individual antigen administration, suggesting a potential synergistic effect. Cytotoxicity assays showed low toxicity for the tested proteins, with BJ cell viability remaining above 70% even at the highest concentration tested, indicating biocompatibility. Conclusion: Malaria continues to pose a significant public health challenge in sub-Saharan Africa, where it accounts for most global cases and deaths, especially among children and pregnant women. The endorsement of two license malaria vaccines, RTS, S/AS01 and R21 represents a major milestone, however, both vaccines face limitations with modest efficacy. This study demonstrates the successful cloning, expression, and initial evaluation of four P. falciparum vaccine candidate proteins. Their low cytotoxicity and high immunogenic potential support their further development as components of a multistage malaria subunit vaccine. The promising findings of this study provide a foundational step toward developing a more effective, multistage malaria vaccine, which could play a critical role in reducing the disease burden and supporting elimination efforts in the most affected regions.
Rekombinant faj tail proteinlerinin bakterilere adezyonundaki rollerinin araştırılması
Amaç: Proteus mirabilis ve Proteus vulgaris, özellikle kateter ilişkili üriner sistem enfeksiyonları (CAUTI), piyelonefrit, sepsis ve taş oluşumu gibi ciddi klinik tablolarda rol alan önemli fırsatçı patojenlerdir. Bu bakterilerin sahip olduğu yüzey yapıları, biyofilm oluşturma kapasitesi ve artan antibiyotik direnci, enfeksiyonların tanı ve tedavisini güçleştirmektedir. Bu tez çalışmasının temel amacı, P. mirabilis RP6 ve P. vulgaris RP7 bakteriyofajlarından elde edilen reseptör bağlayıcı proteinler (RBP), Gp35 ve Gp106'nın rekombinant üretimi ve tanısal potansiyellerinin detaylı olarak değerlendirilmesidir. Çalışma, bu proteinlerin özgüllük, duyarlılık, bağlanma spektrumu, biyolojik örneklerdeki performansı, faj adsorpsiyonunu engelleme kapasitesi ve antibakteriyel/sitotoksik etkileri bakımından karakterize edilmesini hedeflenmiştir. Gereç ve Yöntem: Gp35 ve Gp106 proteinlerini kodlayan gen dizileri, spesifik primerler kullanılarak PCR ile amplifiye edilmiş ve elde edilen amplikonlar pET-30a(+) ekspresyon vektörüne klonlanmıştır. Klonlama işlemi doğrulandıktan sonra, rekombinant proteinler Escherichia coli BL21 (DE3) hücrelerinde eksprese edilmiş ve Ni-NTA afinite kromatografisi kullanılarak saflaştırılmıştır. Saflaştırılan RBP'lerin Proteus spp.'ye özgü bağlanma kapasiteleri kristal viyole boyama ve ELISA yöntemleriyle analiz edilmiştir. Farklı bakteri yoğunluklarıyla gerçekleştirilen C-ELISA deneyleri ile RBP'lerin tespit limitleri belirlenmiş, bağlanma spektrumları ise 49 klinik izolat ile test edilmiştir. Ayrıca, idrar gibi biyolojik ortamlarda bağlanma performansı test edilmiş ve rekombinant proteinlerin fajlar ile aynı reseptör bölgelerine bağlanıp bağlanmadığı rekabetçi adsopsiyon deneyleri ile ortaya konmuştur. Rekombinant proteinlerin antibakteriyel etkisi spot-test analizi ile, sitotoksisite ise insan fibroblast hücrelerinde WST-1 yöntemiyle belirlenmiştir. Bulgular: Gp35 ve Gp106 proteinleri yalnızca Proteus spp. izolatlarına bağlanmış, heterolog bakterilere (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus) karşı sinyal üretmemiştir. C-ELISA tabanlı duyarlılık analizlerinde her iki protein de ≈10³ CFU/mL sınırında hedefe özgül bağlanma gösterebilmiştir. Bağlanma spektrumu analizinde Gp35'in Proteus izolatlarının %82,5'ine, Gp106'nın ise %90'ına bağlandığı saptanmış; bu durum Gp106'nın daha geniş bir konak aralığına sahip olduğunu göstermiştir. Ayrıca, bazı izolatlarda Gp35 ve Gp106 bağlanmasına rağmen ilgili fajların enfekte edememesi, RBP'lerin tanı platformlarında fajlara göre daha geniş spektrum sunabileceğini ortaya konmuştur. Biyolojik örneklerde yapılan testlerde RBP'ler, idrar ortamında özgüllüklerini koruyarak hedef bakterilere başarıyla bağlanmıştır. Rekabetçi faj adsorpsiyon testlerinde ise Gp35 ve Gp106'nın, RP6 ve RP7 fajlarının hedef hücrelere bağlanmasını %65–80 oranında engellediği belirlenmiştir. Bu sonuç, her iki proteinin de fajların bağlandığı özgül reseptörlere yöneldiğini ve bu reseptörleri işgal ederek faj enfeksiyonunu baskılayabildiğini göstermiştir. Son olarak, her iki RBP'nin de uygulandığı bakterilerde herhangi bir antibakteriyel etki gözlemlenmemiş, dolayısıyla yalnızca hedef tanıma ve bağlanma işlevi gördükleri belirlenmiştir. Ayrıca, bu iki rekombinant proteinin insan fibroblast (BJ) hücre hattı üzerinde de herhangi bir sitotoksik etki göstermediği tespit edilmiştir. Sonuç: Bu tez çalışması, Proteus spp.'ye özgül rekombinant RBP'lerin ilk sistematik karakterizasyonunu sunmaktadır. Gp35 ve Gp106, tanı uygulamalarında kullanılmak üzere yüksek özgüllük, geniş spektrum, klinik örnek uyumluluğu ve hedef reseptör doğruluğu gibi özellikleri bir arada taşıyan adaylardır. Antibakteriyel veya sitotoksik etkiler göstermemeleri sayesinde, canlı hücre tespiti gereken uygulamalarda güvenle kullanılabilirler Literatürde benzer örnekleri bulunan RBP-temelli tanı sistemleriyle karşılaştırıldığında, bu çalışma, Proteus spp. enfeksiyonlarının hızlı, duyarlı ve özgül teşhisinde kullanılabilecek biyo-tanıma platformları için önemli bir temel oluşturmaktadır. Ayrıca, bu reseptör bağlayıcı proteinler, yalnızca tanı amaçlı değil, aynı zamanda hedefe yönelik tedavi stratejilerinde, örneğin nanopartiküllere bağlanarak antimikrobiyal ajanların hedefe taşınmasında da kullanılabilecek biyolojik araçlar olarak öne çıkmaktadır.
Restoration of vancomycin sensitivity using antisense RNA and investigation of its efficacy in vancomycin-resistant Enterococci in infected mice
Purpose: This study aimed to restore susceptibility in vancomycin-resistant Enterococcus strains using plasmid-encoded antisense RNA (asRNA) of the vanA/vanB genes, and to examine their in vivo efficacy in an experimental mouse model. Materials and Methods: The vanA and vanB genes were amplified by PCR from clinical E. faecium VRE50 and E. faecalis V583, respectively, then reverse cloned into pUC19 plasmid to generate antisense RNAs via restriction enzyme sites. These constructed plasmids with reversly oriented genes were transformed into E. coli DH10B. Then, asRNAs, for vanA and vanB were extracted and their abilities to restore vancomycin susceptibility were tested in vitro in the presence of vancomycin. The vancomycin MIC was done with or without asRNA and during 24-hour OD595 measurements were taken over 24 hours to generate growth curves. For in vivo analysis, liposome encapsulated and free asRNAs were administered intraperitoneally to VRE-infected CD-1 mice with vancomycin, and treatment outcomes were assessed by measuring CFU to calculate bacterial loads in peritoneal fluid. Additionally, murine sepsis scores of the mice were recorded and determined daily. Results: Acording to in vitro studies, while antibiotic susceptibility tests showed a remarkable reduction in vancomycin MIC values, decreasing from >256 µg/mL in the wild-type strain to 32 µg/mL in expressing vanA-antisense RNA by fusion plasmid in clinical VRE50, vanB-asRNA reduced in vancomycin MIC value from 64 µg/mL (MIC value of E.faecalis V583) to 16 µg/mL. Growth kinetics analyses revealed extended lag phases and reduced growth rates in antisense-expressing VRE strains, supporting the functional repression of resistance gene expression. In the murine sepsis model, mice treated with the combination of intraperitoneal antisense RNA and vancomycin exhibited significantly lower bacterial burdens in peritoneal fluid and improved clinical scores compared to control groups. While liposomal formulations were tested for in vivo delivery, their therapeutic efficacy appeared limited, possibly due to insufficient uptake or delayed release. Collectively, these results indicate that antisense RNA constructs can effectively impair van gene function both in vitro and in vivo, restoring antibiotic susceptibility and attenuating infection severity. Conclusion: This study demonstrates that plasmid-derived antisense RNAs targeting the vanA and vanB genes can effectively resensitize vancomycin-resistant Enterococcus strains both in vitro and in vivo. As a reversible and highly specific gene-silencing approach that does not require genome editing, antisense RNA technology emerges as a promising new strategy in the fight against antimicrobial resistance. Beyond its application to VRE, this method holds potential for targeting resistance genes in a wide range of multidrug-resistant pathogens.
Rekombinant MrkD proteininin fibroblast hücresine ve kolajene adezyondaki rolünün belirlenmesi
Amaç: Bu tezde, rekombinant olarak üretilen MrkD proteininin insan fibroblast hücreleri ve kolajenle olan etkileşimi moleküler düzeyde incelenmiş, bu proteinin potansiyel terapötik hedef olarak değerlendirilmesi amaçlanmıştır. Gereç ve Yöntem: Rekombinant DNA teknolojisi ile K. pneumoniae'nin mrkD geninin çoğaltılması için primerler tasarlanmış ve çoğaltılan gen pET30a(+) ekpresyon vektörüne klonlanmıştır ardından E. coli BL21 hücrelerine transforme edilmiştir. MrkD proteini IMAC yöntemi ile saflaştırılmış, fibroblast hücre hattına karşı sitotoksitesi ve K. pneumoniae'nin hücreye bağlanabilme potansiyelindeki etkisi incelenmiştir. Ayrıca MrkD proteininin Tip V kolajen ile olan etkileşim değerleri ELISA yöntemi ile ölçülmüştür. Bulgular: Saflaştırılan MrkD proteininin boyu 40.8 kDa olarak hesaplanmıştır. MrkD proteinin tip V kolajen ile etkileşim gösterdiği ELISA yöntemi ile doğrulanmıştır. Proteinin BJ fibroblast hücrelerine dair herhangi bir sitotoksik etkisinin olmadığı Wst-1 yöntemi ile belirlenmiştir. MrkD proteini K. pneumoniae'nin Bj hücrelerine bağlanma potansiyelini yaklaşık 0,85 log azaltmıştır. Sonuç: Bu çalışma kapsamında, BJ insan fibroblast hücreleriyle MrkD proteini arasında gerçekleşen etkileşim ilk kez deneysel olarak ortaya konmuş ve protein yapısının sitotoksik potansiyeli doğrudan analiz edilmiştir. Elde edilen sonuçların, MrkD proteininin kolajenle ilişkisini açıklığa kavuşturması ve tedavi hedefi olabilecek yapılar için yol gösterici olması beklenmektedir.