Wilson hastalığına yol açan ATP7B genindeki mutasyonların bakır taşınmasındaki etkilerinin saccharomyces cerevisiae model sisteminde araştırılması

Amaç : Klinik bulguları farklı Wilson Hastalarında saptanan ATP7B genindeki T788I, V1036I ve R1038G-fsX83 mutasyonları ve yaban tip ATP7B geni, yaban tip BY4741 (MAT? his3?1 leu2?0 met15?0 ura3?0) suşundan elde edilmiş CCC2 geni mutant olan (BY4741 ?CCC2) Saccharomyces cerevisiae suşuna transformasyonuyla bakır miktarındaki değişimin saptanması amaçlandı.Yöntem : Hepatoselüler karsinoma hücre dizisi HepG2?den total RNA izolasyonu yapılıp cDNA elde edildi. Yaban tip ATP7B genine özgül primerler kullanılarak ATP7B geni PCR ile çoğaltıldı, plazmid DNA?sına klonlandı.Yaban tip ATP7B?yi içeren plazmid DNA?sında bölge yönlendirilmiş mutagenez `site directed mutagenesis? yöntemi ile T788I, V1036I ve R1038G-fsX83 mutasyonları elde edildi. DNA dizi analizi ile yaban tip ATP7B, T788I, V1036I ve R1038G-fsX83 mutant hücrelerden elde edilen plazmid DNA?larının dizileri doğrulandı. Yaban tip ATP7B, T788I, V1036I ve R1038G-fsX83 mutantları Saccharomyces cerevisiae (BY4741?CCC2) transforme edildi.Konvansiyonel PCR ve real time PCR yapıldı. Komplementasyon deneyi yapılarak ICP MS analizi ile farklı ortam şartlarında, ortamdaki ve hücre pelletlerindeki bakır ve demir miktarı ölçüldü.Bulgular : BY4741 ?CCC2 suşunda , ATP7B geninin mayadaki CCC2 genini komplemente ettiğive işlevsel olduğu gösterildi. Demir sınırlı ortamda, yaban tip ATP7B?ye göre T788I, V1036I ve R1038G-fsX83 mutantlarında hücre kültür ortamındaki bakır miktarının azaldığı ve hücre pelletlerindeki bakırın arttığı gösterildi. Kontrol ortamlarında hem ortam hem de hücre pelletlerinde bakır miktarında fark saptanmadı. Aynı deney şartlarında, yaban tip ATP7B?ye göre mutantlarda hem ortam hem de pelletlerde ölçülen demir miktarında fark saptanmadı. Sonuç : Demir sınırlı ortamda yaban tip ATP7B?ye göre T788I, V1036I ve R1038G-fsX83mutasyonlarında hücre kültür ortamındaki bakırın azaldığı, hücre pelletlerindeki bakırın arttığı gösterildi. ICP-MS ile yapılan ölçümlerde yaban tip ATP7B ile üç mutant arasında bakır taşınımında fark saptandı, hipotezimiz doğrulandı. BY4741?CCC2 genetik özelliğindeki mutant maya suşuna ilk kez insan bakır taşıyıcı geni ATP7B transforme edildi ve komplemantasyon gösterildi. Farklı klinik özelliklere sahip Wilson hastalarındaki mutasyonlara ait model sistem kurulmuş oldu.Anahtar Sözcükler : Wilson hastalığı, bakır, ATP7B , mutasyon, CCC2 , maya