Β-1,4-glukanaz enzimini üreten toprak bakterisinin izolasyonu ve in vitro mutagenez ile genetik modifikasyonu

Çalışmada toprak örneklerinden Bacillus sp. suşları pH 5.0-6.0'da ve iki ayrı sıcaklıkta (37℃ ve 50℃) izole edilmiş ve bu izolatlarda β-1,4-glukanaz (CMCaz) enzimi üreten bakteri suşları belirlenmiştir. Bu izolatlardan Bacillus sp. AZH suşu seçilerek (β-1,4-glukanaz +, α-amilaz+, ksilanaz-, proteaz+) α-amilaz, ksilanaz, proteaz gibi istenmeyen enzim genleri Ethidium bromide (EtBr) ve Ultraviole ışını (UV) kullanılarak mutasyon ile köreltilmiş böylece sadece β-1,4-glukanaz üreten mutant suşlar (Bacillus sp. AZH-mEB, Bacillus sp. AZH-mUV) elde edilmiştir. Bacillus sp. AZH (yabani suş) ve mutant varyeterine (Bacillus sp. AZH-mEB, Bacillus sp. AZH-mUV) ait enzim aktiviteleri; miktar, fiziksel ve biyokimyasal özellikleri yönünden karakterize edilmiştir. Optimum sıcaklık değerleri Bacillus sp. AZH ve Bacillus sp. AZH-mEB için 50℃ olarak, Bacillus sp. AZH-mUV için ise 60℃ olarak bulunmuştur. Optimum pH değerleri araştırılmış ve elde edilen verilere göre optimum pH değerleri Bacillus sp. AZH için 9.0; Bacillus sp. AZH-mEB için Bacillus sp. AZH-mUV için ise 7.0 olduğu tespit edilmiştir. Bacillus sp. AZH ve Bacillus sp. AZH-mEB, Bacillus sp. AZH-mUV mutant varyeterine ait β-1,4-glukanaz enziminin üretim seviyeleri karşılaştırılmış ve relatif aktivitelerinin sırasıyla; %100, %100 ve %71,5 olarak bulunmuştur. Sıcaklık direnci ölçümlerinde Bacillus sp. AZH-mUV 30℃, Bacillus sp. AZH-mEB ve yabani suşta 40℃'de ön inkübasyon sonrasında %100 aktivite göztermişlerdir. Bu üç suşta ayrıca metal iyonların etkisi de araştırılmış (CaCl2, MgCl2, KCl2, EDTA, üre); yabani suş ve Bacillus sp. AZH-mUV'de tüm iyonların enzim aktivitesini arttırdığı ancak Bacillus sp. AZH-mEB'de üre ve MgCl2 varlığında enzim aktivitesinin düştüğü gözlemlenmiştir. Son olarak her üç bakteriye ait selülaz enzimlerinin moleküler ağırlıkları SDS-PAGE ve zimogram analizleri ile yaklaşık olarak 40 kDa olduğu belirlenmiştir.