Anoxybacillus gonensis G2t glukoz izomerazının ısıl kararlılığının K111R-L313I-V101R-A353G/F/W VE T428E/S bölge spesifik mutasyonları ile geliştirilmesi

Glukoz izomeraz hücre içi bir enzim olup birçok ermofilik ve mezofilik bakteri ve çeşitli mantarlar tarafından üretilebilen bir enzimdir. Asıl ismi ksiloz izomeraz olmasına rağmen, D-Glukozu D-Fruktoza çevirebilme yeteneği sebebiyle özellikle endüstriyel alanda HFCS üretiminde yoğun olarak kullanıldığı için, yaygın ismi glukoz izomeraz olarak bilinmektedir. Bu enzim, hem hemisellülozdan etanol üretimine yardımcı olduğu için hem de fruktoz şurubu diğer adıyla HFCS (High Fructose Corn Syrup) üretiminde kullanıldığı için büyük endüstriyel öneme sahiptir. Bu çalışma kapsamında ekibimiz, daha önce genetik manipülasyonlarla kinetik özellikleri geliştirilmiş olan A. Gonensis G2T glukoz izomerazının yine aynı yöntemler ile ısıl kararlılığını arttırmayı amaçlamaktadır. Bu amaçla yaban tip enzim üzerinde V101R, K111R, L313I, A353G, A353F, A353W, T428S ve T428E bölge özgün mutasyonları ile enzimin ısıl kararlılığının arttırılması çalışılmıştır. V101R ve K111R mutasyonları yaban tip enzimin yarılanma ömrünü 19 günden sırasıyla 31 ve 37 güne çıkarmıştır. Enzimin yarılanma ömründe artışa yol açan bu mutasyonlar ikili olarak birlikte uygulanmış ve bu amaçla V101R- K111R, çiftli mutasyonu gerçekleştirilmiştir. İki mutasyon birlikte uygulandığında enzimin ısıl kararlılığı 19 günden 11,5 güne düşmüştür. Ayrıca V101R ve K111R, mutasyonları katalitik etkinliği yaklaşık 9 kat arttırılmış olan W137F –V184S mutant enziminde de tekrarlanmıştır. Bu çalışmalardan W137F – V184S – K111R üçlü mutasyonları ile düşük Km, yüksek Vmax ve katalitik etkinliğe sahip mutant enzim elde edilmiştir.