AtBOR4 geni ortoloğunun Gypsophila perfoliata L. genomunda tanımlanması ve karakterizasyonu

Bor, bitkiler için esansiyel bir mikro elementtir. Bor toksisitesi yağışın düşük olduğu, kurak ve yarı kurak topraklarda tarımsal üretimi sınırlayıcı bir etkendir. Toksik seviyede bor içeren toprakların ıslahı son derece zordur. Bu sorunun çözümü için bu bölgelere iyi şekilde uyum sağlamış Gypsophila perfoliata L.'nın gen kaynakları araştırılarak, bora tolerans mekanizmasının aydınlatılması amaçlanmaktadır. Tanımlanan genlerin, bor toksisitesine dayanıklı bitki türlerinin geliştirilmesine ve fitoremedasyon çalışmalarına katkı sağlayacağı düşünülmektedir. Tez çalışmasında bu amaçlar doğrultusunda, G. perfoliata'ya 500 mg/L bor uygulanması sonucu 6 saatlik örneklerden RNA izolasyonu yapılarak oluşturulmuş mevcut cDNA kütüphaneleri, Saccharomyces cerevisiae BY4743Δatr1 mayalarına elektroporasyon yoluyla aktarılmıştır. Mayalar için toksik kabul edilen 80 mM borik asit içeren ortamda, kök cDNA kütüphanesi kullanılarak gerçekleştirilen maya fonksiyonel tarama testinde bor toleransı gösteren koloniler seçilmiştir. Seçilen koloniler, artan konsantrasyonlarda borik asit içeren ortamlarda damlatma testi ve seri dilüsyon analizleri ile doğrulanmıştır. Mayaların taşıdığı plazmitler izole edilip tekrar mayaya aktarıldığında sadece PKB26 olarak isimlendirilen maya suşunun dayanıklılığını sürdürdüğü tespit edilmiştir. PKB26 maya suşu, borik asit konsantrasyonu 300 mM'e kadar olan ortamlarda hayatta kalabilmektedir. PKB26'nın taşıdığı toleranstan sorumlu plazmit içindeki cDNA'nın Arabidopsis thaliana HCO3- transporter family (BOR4) geniyle %72,9 oranında homoloji gösterdiği tespit edilmiştir. Bu cDNA, GpBOR4 (Gypsophila perfoliata BOR4) olarak adlandırılmıştır. GpBOR4 geni EGFP geni ile füzyon yapılarak BY4743Δatr1 mayada hücre içi lokalizasyonuna konfokal mikroskop ile bakılmış, proteinin plazma membranına lokalize olduğu tespit edilmiştir. Mayada yapılan hücre içi bor miktarı analizinde gen taşımayan maya ile kıyaslandığında GpBOR4 genini taşıyan mayaların hücre içinde daha az bor bulundurduğu tespit edilmiştir. Tanımlanan bu genin karakterizasyonu için bor4 mutant ve Col-0 (WT) Arabidopsis thaliana hatlarına Agrobacterium yoluyla floral dip yapılarak gen aktarılmıştır. Transgenik Arabidopsislerin toksik bor koşullarında gelişimi izlenmiştir. Transgenik bitkilerin gen ifadesi qPCR ile belirlenmiştir. Col-0 ekotipine GFPGUSPlus vektörüyle aktarılan GpBOR4 geni 3 transgenik hatta 10 mM'da hayatta kalma özelliği kazandırmıştır. GpBOR4 geninin G. perfoliata genomunda kaç kopya olduğunu saptamak amacıyla southern blot yapılmıştır. G. perfoliata'nın bor stresi altında GpBOR geninin ifadesini 12 saatte neredeyse 7 kat arttırdığı tespit edilmiştir. Elde edilen sonuçlar, bor toksisitesine karşı yüksek düzeyde tolerans gösteren G. perfoliata'da bor atımından sorumlu genin tanımlanmasının, bora hassas bitkilerin ıslahına önemli katkılar sağlayabileceğini düşündürmektedir.