Bacıllus fitazının klonlanması ve ekspresyonu

Fitaz enzimi fitatın fosfomonoester bağını hidrolize ederek myo-inositol fosfat ve inorganik fosfatın ortaya çıkmasına sebep olur. Hayvanların büyümeleri, üremeleri ve kemiklerinin şekillenmesi için önemli minerallerden biri fosfordur. Yapılan bu araştırmada fitaz aktivitesine sahip olan doğal Bacillus sp. biyokimyasal ve 16srDNA sekans analizi ile Bacillus subtilis olarak tanımlanmıştır. Primerler NCBI sitesinde olan Bacillus subtilis bakterisinin fitazına göre dizayn edilmiştir. PCR amplifikasyonundan sonra fitaz geni ekspresyon vektörü olan pET22b vektörüne ligasyonu yapılmıştır ve Rekombinanat vektör ısı şoku metodu ile E. coli Rosetta 2(DE3) pLysS bakterisine aktarılmıştır. Kullanılan PCR ürünü ve vektör ligasyonu yapılmadan önce Hind III ve BamH1 enzimleri ile kesimleri gerçekleştirilmiştir. Rekombinant fitaz 37oC, pH 7'de optimum aktivite göstermiştir. Enzimin 60oC'de aktivitesinin %73'nü ve 100 oC'de ise aktivitesinin %5'ni korumuştur. Enzim pH 5.8-8 aralığında stabildir. Rekombinant enzimin aktivitesi 5mM CoCl2 ile artmıştır ama MgCl2, CuCl2, HgCl2, NiCl2, MnCl2, FeCl2 ve EDTA ile aktivitesi düşmüştür. Rekombinant fitazın moleküler ağırlığı SDS-PAGE analizi ile 45 kDa olarak belirlenmiştir. Bu araştırmanın sonuçlarına göre elde edilen rekombinant fitazın yem katkısı olarak kullanılabilirliği ortaya konulmuştur. Anahtar Kelimeler: Fitaz, pET22b, Bacillus subtilis, klonlama