Cryptosporidium parvum'da transient transformasyon

Bu çalışmanın amacı Cryptosporidium parvum için genetik transformasyon sistemini (transient transformasyon) kurmaktır. Genetik transformasyon gen fonksiyonlarını analiz etmek için gerekli olup, C. parvum genleri ile henüz böyle bir analiz gerçekleştirilmemiştir. Bu amaç doğrultusunda C. parvum'un ribosomal protein genlerini ( BX538351 segment 2/4 L11 protein genleri üzerinde 84361- 85501 baz dizisi) taşıyan Crypto-construct GFP plazmidinin, C. parvum sporozoitlerine transformasyonu elektroporasyon ve lipofektamin yöntemleri kullanılarak yapılmıştır. Hücre kültürlerinde elde edilen transformantlar invert floresan mikroskop ve revers- transkriptaz PCR ile doğrulanmıştır. Transformasyon ve elektroporasyon koşullarını optimize etmek için Crypto construct GFP vektörün yanı sıra pCMV-DsRed, pEYFP-Mem ekspresyon vektörleri de kullanılmıştır. C. parvum sporozoitlerini açığa çıkarmak için kullanılan eksistasyon koşulları içinde ookistlerin % 80 oranında Taurocholic acid /cytomix:RPMI-1640 (1:1) besi ortamında existe olduğu gözlenmiştir. Bu ortam içerisinde bir elektrik akımı verilerek elektropore edilen sporozoitlerin HCT-8 hücre kültürlerini daha iyi infekte ettiği belirlenmiştir. Hem elektroporasyon hem de lipofektamin yöntemiyle pCMV-DsRed ve pEYFP-Mem vektörlerinin HCT-8 hücre kültürlerine transfeksiyonu sağlanmıştır. Elektroporatörün 180 V, kapasitans 250 ?F, resistans yok şeklinde ayarlandığı koşullar altında pCMV-DsRed ve pEYFP-Mem vektörlerinin HCT-8 hücre kültürlerindeki ekspresyonları floresan mikroskop altında gözlenirken, elektroporatörün 1000 V, 50 ?F, 50 ? şeklinde ayarlandığı koşullarda bu vektörlerin HCT-8 hücre kültürlerindeki ekspresyonları floresan mikroskop altında gözlenememiştir. Her iki elektroporasyon koşulları altında Crypto construct GFP Vektörün transfeksiyonu sonucunda floresan mikroskop altında gözle görülebilir ekspresyon elde edilememiştir. Yapılan RT-PCR ve Nested PCR ile az olan GFP mRNA ekspresyonu gözlenmiştir. Anahtar Kelimeler: Cryptosporidium, Hücre Kültürü, Elektroporasyon, Lipofektamin, Real time PCR