D-Tagatoz 3-Epimeraz enzimi üretimi ve fruktozdan alluloz (psikoz) eldesi

Bu çalışmada rekombinant DNA teknolojisiyle "D-Tagatoz 3-Epimeraz (D-TE)" enzim üretimi gerçekleştirilmiştir. D-TE enzim çözeltisi kullanılarak fruktoz nadir bir şeker olan alluloz (D-psikoz)'a dönüştürülmüştür. D-Tagatoz 3-Epimeraz enzim geni Escherichia coli JM109'dan izole edilip PCR ile çoğaltılmıştır. Konakçı hücre olarak da Escherichia coli JM109 kullanılmış ve enzim geni plazmid yardımıyla bu mikroorganizmaya aktarılmıştır. Gen aktarımı yapılan konak hücre 37 °C'de 24 saat boyunca çalkalamalı inkübatörde gelişmeye bırakılmış ve 24 saat sonunda spektrofotometrede 600 nm dalga boyunda yeterli gelişme olup olmadığı ölçülmüştür. OD600 değeri 0.61'e ulaştıktan sonra enzimin daha hızlı üretilebilmesi amacıyla son konsantrasyonda 0.1 mM olacak şekilde IPTG ilave edilmiş ve 18 °C'de bir gece bekletilerek protein ekspresyonu gerçekleştirilmiştir. İnkübasyon sonunda hücreler santrifüjle toplanarak enzim üretimi gerçekleştirilmiştir. Üretilen enzim His GraviTrap saflaştırma kolonu yardımıyla saflaştırılmış ve saf enzim elde edilmiştir. Daha sonra saflaştırılmış D-TE enzim çözeltisinden %1, %5 ve 50'lik fruktoz çözeltisi üzerine %5 oranında ilave edilip 20 °C, 40 °C, 60 °C, 70 °C ve 80 °C'de 24 saat süreyle bekletilmiştir. Bu aşamada ilk 8 saat boyunca her 2 saatte bir ve 24. saat sonunda numune alınarak HPLC'de analiz edilmiş ve D-TE aktivitesi sonucu fruktozdan dönüşen alluloz miktarı tespit edilmiştir. D-TE enzim aktivitesi için en uygun sıcaklığın 60 oC olduğu ve bu sıcaklık derecesinde bekletilen %50'lik fruktoz çözeltisine ait örneklerde 2., 4., 6., 8. ve 24. saatlerde yapılan HPLC analizleri sonucu fruktozun alluloza dönüşüm oranının sırasıyla %10.32, %12.66, %15.32, %15.78 ve %20.76 olduğu belirlenmiştir.