Doğal Bacillus thuringiensis suşlarının bakteriyosin benzeri peptid üretim potansiyellerinin araştırılması

Bacillus thuringiensis (Bt) gram pozitif bir bakteridir ve Cry, Cyt ve Vip proteinleri gibi metabolit üretimi için model bir organizma olduğu düşünülmektedir. Buna ilaveten, Bt'nin antimikrobiyal proteinler de sentezlediği bilinmektedir. Bt'nin biyopestisit ile ilgili proteinleri hakkında çok fazla bilgi olmasına rağmen, Bt bakteriyosinleri hakkında çalışmalar kısmen sınırlıdır. Dolayısıyla bu tez çalışmasında, Bt koleksiyonumuzda bulunan ve zeytin alanlarından toplanıp karakterize edilen yaklaşık 100 adet Bt suşunun bakteriyosin üretme potansiyelleri araştırılmıştır. Bunun için Bt suşları tekrar canlandırılıp, agar spot assay ile indikatör bakteri B.cereus 11778 (ATCC)'e karşı bakteriyosin aktiviteleri taranmıştır. Antimikrobiyal aktivite gösteren suşlardan elde edilen süpernatantların (CFS) antimikrobiyal etkisi kuyu difüzyon assay ile teyit edilmiş ve sadece 9 tanesinin B. cereus'a karşı antimikrobiyal etki gösterdiği saptanmıştır. Bunlar arasından en yüksek inhibisyon zonu gösteren 28Q1 suşu diğer analizlerde kullanılmak üzere seçilmiştir. Bu suşun büyüme eğrisi ve bakteriyosin üretim kinetiği araştırıldığında, büyüme eğrisinin logaritmik fazının başlarında primer metabolit olarak bakteriyosin benzeri peptid (BBP) sentezlendiği, maksimum antimikrobiyal aktivitenin (180 AU/ml) ilk 8 saatte gözlendiği ve 30 saatte aktivitenin tamamen kaybolduğu tespit edilmiştir. CFS çeşitli enzimlerle muamele edildiğinde, Proteinaz K (PK) ve lipazda aktivitenin tamamen kaybolması BPP'nin bir çeşit lipoprotein olduğunu göstermektedir. İlk 30 dakikada CFS'nin antimikrobiyal aktivitesi 300C ve 400C'de maksimumken, 500C'de yarıya inmekte ve 600C'de tamamen yok olmaktadır. Ayrıca, CFS'nin pH aralığının geniş olduğu (pH4-pH10) bulunmuştur. Bt 28Q1 suşu farklı besi ortamlarında büyütüldüğünde, B. cereus'a karşı en yüksek anti mikrobiyal aktivite triptik soy broth'da (TSB) gözlenmiştir. İlaveten, çeşitli organik çözücülerin antimikrobiyal aktiviteyi etkilemediği fakat Triton x-100'ın aktiviteyi arttırdığı kaydedilmiştir. Amonyum sülfat (%80) ile çöktürülen ve diyaliz edilen BBP preparasyonun (BBPP) ve CFS'nin antimikrobiyal etki spektrumu çeşitli bakteriler üzerinde incelendiğinde, sadece B. cereus dahil incelenen tüm Bacillus türleri üzerinde etkili olduğu; buna karşın, diğer Gram+ ve Gram- bakteriler ve Candida albicans üzerinde antimikrobiyal aktivite göstermediği tespit edilmiştir. Ayrıca, kısmi olarak saflaştırılan ve antimikrobiyal aktivite gösteren proteinin moleküler ağırlığının SDS-PAGE ve jel overlay assay yöntemiyle yaklaşık 12 kDa olduğu bulunmuştur. İlaveten, Bt 28Q1 suşunun 16SrDNA ve flagellin hag geni PCR analizlerine göre Bacillus thuringiensis subsp. tochigiensis olduğu gösterilmiştir. Sonuç olarak, B. thuringiensis 28Q1 suşundan elde edilen ve geniş pH aralığı ve belirli sıcaklık toleransına sahip olan bakteriyosin benzeri protein (BBPP) besin paketlenmesinde, B. cereus gibi besinlerde toksin üreten ve ishale yol açan bakterilerin büyümesini engellemek için koruyucu veya biyoaktif molekül olarak kullanılma potansiyeline sahiptir. Gelecekte yapılacak protein sekans analizleri ve proteomik çalışmalar BBPP'nin detaylı karakterizasyonuna önemli katkı sağlayacaktır.