Escherichia coli'de aska klon koleksiyonu ve fonksiyonel genomik yaklaşımıyla propolisin antibakteriyel etkisine karşı direnç sağlayan genlerin araştırılması

Genomik yaklaşım ve genom boyu plazmid kütüphaneleri, son yıllarda binlerce genin hızlıca taranarak, antimikrobiyal hedeflerin bulunmasında ve onaylanmasında kullanılmaktadır. Bilindiği gibi günümüzde patojen bakterilerin antibiyotiklere karşı direnç kazanması sonucu, yeni ilaç adayı moleküller için bilimsel arayış devam etmektedir. Zararlı bakterileri veya diğer hastalık kaynağı hücreleri öldürebilecek veya gelişmesini inhibe edebilecek sentetik ve doğal bileşiklerin keşfedilip onaylanması yanında, bu bileşiklerin hücresel hedeflerinin ve etki mekanizmalarının araştırılması gerekmektedir. Laboratuvarımız bünyesinde bulunan Escherichia coli ASKA genom boyu plazmid kütüphanesi koleksiyonu (ASKA klon koleksiyonu), rekombinant plazmidlere klonlanmış 4123 farklı geni içeren 4123 suştan oluşmaktadır ve bu koleksiyon, literatürde bazı antimikrobiyal bileşiklerin hücresel hedeflerini ve aynı zamanda hücresel cevap sürecinde görev olabilecek genleri tespit etmede kullanılmıştır. ASKA klon koleksiyonu genomik çalışmalarda kullanılan eşsiz ve güçlü bir deneysel kaynaktır. Bu tez projesinde, bölgemizde de çok bulunan doğal ürün propolisin su ekstraktının antibakteriyel hedefleri ve hücresel cevapta rol alabilecek aday genleri araştırılmıştır. Propolis, arılar tarafından üretilen ve bitki kaynaklı bileşiklerden oluşan doğal ve reçineli bir karışımdır. Propolis ekstraktlarının antimikrobiyal ve antikanser etkileri bilinmektedir. Ancak propolisin hücrede hangi gen veya ilgili ürünleri ve süreçleri hedeflediği bilinmemektedir. Aynı zamanda hücrenin propolise maruz bırakıldığında hangi genlerin kullanıldığına dair veriler yetersizdir. Bu tez çalışmasında, 4123 adet klonlanan geni içeren "ASKA klon havuzu" ile, artan propolis konsantrasyonlarda seleksiyon çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Rekombinant plazmidlerde (pCA24N::genX), klonlanan genler T5 promotoru ve lac operatörü tarafından transkripsiyonel kontrol altındadır ve gen ekspresyonu IPTG kullanılması ile kontrol edilebilmektedir. ASKA klon havuzundaki 4123 suş yetiştirilerek, artan konsantrasyonlarda propolis su eksktraktı içeren gradient besi yerine ekilmiştir. Propolis konsantrasyonu arttırıldıkça, belli konsantrasyonlarda tüm bakteri suşları ölmüş, ancak bazı suşlar ölmemiş ve yaşayabilmiştir. 28 adet göreceli olarak yüksek tolerans seviyesine sahip suş belirlenmiştir. Bu suşların içindeki rekombinant plazmidlerde bulunan genler, propolisin antibakteriyel etkisine karşı doğrudan veya dolaylı yolla direnç sağlayan genler olarak değerlendirilmiş ve onaylama çalışmaları yapılmıştır. Onaylama çalışmalarında kontrol suşuna göre, göreceli olarak daha yüksek konsantrasyonda üreme gösteren 7 adet koloni seçilmiştir. Seçilen kolonilerden plazmid izolasyonu yapılmış ve restriksiyon enzimle kesim işlemi uygulanmıştır. Kesim sonucu seçilen tolerant kolonilerin insert büyüklükleri belirlenmiştir. Hedef genlerin dizilerini belirlemek için Sanger sekans analizi yapılmış ve biyoinformatik analizler sonucu aaeR, cmtB, prpE gen bilgilerine ulaşılmıştır. Bulunan genlerin propolise karşı antimikrobiyal direnci sağlamasının nedenini araştırmak için, suşlarla biyofilm çalışmaları yapılmasına karar verilmiş ve biyofilm oluşturma kapasiteleri değerlendirilmiştir. Ayrıca, Escherichia coli yabanıl tip bakteri suşunda propolis ekstraktının belirlenen genlerin ekspresyonu üzerindeki etkisini belirlemek için, Real-Time PCR analizleri ile propolis stresine bağlı mRNA seviyelerine bakılmıştır. Bu tez çalışması, fonksiyonel genomik, moleküler mikrobiyoloji ve moleküler genetik disiplinlerinin bazı deneysel yaklaşımlarını kullanan özgün, kapsamlı bir çalışma olarak sonuçlandırılmış ve alanında yeni bilimsel veriler üretmiştir. Anahtar kelimeler: Propolis, ASKA, Escherichia coli, hedef gen, antibakteriyel