Galaktoziltransferaz-ı etkileşim yüzeyinin yönlendirilmiş mutagenez ve in vivo FRET (förster rezonans enerji transfer) analizi yöntemiyle karakterizasyonu

Glikozilasyon, protein ve lipidlerin geçirdiği en iyi bilinen sentez sonrası modifikasyonlardan biridir. Doğru bir glikozilasyon, hücresel tanıma, immünolojik aktivite, hücre sinyalizasyonu ve biyolojik çeşitlilik için son derece önemlidir. Glikan dallanması ve bu süreçte şeker eklenmesi glikozilasyonun temelidir ve şekerleri transfer eden glikoziltransferaz enzimleri tarafından kontrol edilen bir olaydır. Bu enzimlerde oluşan bozukluklar tüm organizma tipleri için hayati sorunlara yol açmaktadır. Fakat henüz glikoziltransferaz enzimlerinin patolojik koşullarda ve sağlıkta nasıl çalıştıkları detaylı olarak belirlenememiştir. 1960' lardan günümüze, çok sayıda glikoziltransferaz enzimlerinin homomerik ve heteromerik çalışma biçimlerine dair araştırmalar yapılmıştır. Biyoinformatik, moleküler biyoloji, ve hücre fizyolojisi alanındaki yeni gelişmeler, protein – protein etkileşimi ile ilgili daha çok veri elde etmemizi sağlamıştır. Tüm bunların ışığında çalışmanın amacı, Beta 1 - 4 Galaktoziltransferaz ezminin etkileşim yüzeyini yönlendirilmiş mutagenez ve FRET analizi ile belirlemektir. Bu doğrultuda, aday amino asitleri belirlemek için bir web sunucusu olan ClusPro kullanılmıştır. Belirlenen aday amino asitler (282 Try, 283 Val, 284 Glu, 359 Ile) Agilent mutagenez kiti kullanılarak teker teker glisin ve aspartik asite çevrilmek üzere mutasyona uğratılmıştır. Mutant cDNA lar mCherry ve mVenus FRET vektörlerine yerleştirilmiştir. Cos-7 hücre hattına transfekte edilen plazmidlerin ürettiği mutant proteinlerin hücre içi yerleşimi LSM konfokal mikrokop kullanılarak doğrulanmıştır. FRET analizi Operetta PerkinElmer cihazında gerçekleştirilmiştir. Sonuç olarak; elde edilen FRET analiz verilerine göre; 282. , 283. ve 359. bölgeler etkileşim yüzeyinden sorumlu olması muhtemel bölgelerdir. Özellikle 283. bölgede yer alan valin amino asidi, homomerik etkileşimde önemli rol oynuyor olabilir.