GLT-1 (Glutamat Transporter 1) promotorunun, SIRT4 (Sirtuin 4) susturulmuş, glia hücrelerinde düzenlenmesi

Amaç: Glutamat Taşıyıcı 1 (GLT-1), sinaptik boşlukta bulunan fazla glutamatı toplayan eksitatör amino asit taşıyıcı (EAAT) protein ailesinin bir üyesidir. SIRT4 (Sirtuin 4), beyindeki glia hücrelerinde eksprese olan ve çeşitli proteinleri deasetile ya da ADP-ribozile edebilen mitokondriyal bir sirtuindir. SIRT4, GLT-1 protein ekspresyonunu düzenleyerek eksitotoksisiteye karşı koruma sağlar. Bu nedenle çalışmada SIRT4'ün GLT-1 geninin transkripsiyonel regülasyonunda etkili olup olmadığını araştırmak amaçlandı. Gereç ve Yöntem: İlk olarak IHA (Immortalized Human Astrocytes) hücre hattında SIRT4'ü susturmak için dizayn edilmiş olan shRNA genini içeren lentiviral partiküller kullanılarak SIRT4 geni susturulmuş olan IHA hücreleri elde edildi. Kontrol ve SIRT4-susturulmuş IHA hücrelerindeki GLT-1 mRNA seviyeleri qPCR yöntemi kullanılarak belirlendi. SIRT4'ün susturulduğunu göstermek için SIRT4 protein ifadesine Western Blot yöntemi kullanılarak bakıldı. GLT-1 promotoru ve transkripsiyon faktörlerinin (CREB, REST ve YY1) etkileşimi CHIP (Kromatin İmmünopresipitasyon) metodu ile kontrol ve SIRT4-susturulmuş IHA hücrelerinde gösterildi. Bulgular: SIRT4, SIRT4'ü susturmak için dizayn edilmiş olan shRNA genini içeren lentiviral partiküller ile IHA hücrelerinde susturulduktan sonra IHA kontrol ve SIRT4 susturulmuş IHA hücreleri olarak iki deney grubu elde edilmiştir. Kontrol ve SIRT4 susturulmuş IHA hücrelerinden protein izole edilerek, SIRT4 protein seviyeleri western blot ile incelenmiş ve SIRT4 geninin susturma işleminin başarılı bir şekilde gerçekleştirildiği gösterilmiştir. Daha sonrasında, her iki hücre grubundan total RNA izole edilmiş, cDNA yapılmış ve GLT-1 mRNA seviyesini belirlemek için qPCR analizi yapılmıştır. Analiz sonucunda, her iki gruptaki GLT-1 mRNA seviyeleri arasında istatiksel olarak anlamlı bir fark görülmediği ortaya çıkmıştır. CREB, REST ve YY1 transkripsiyon faktörlerinin, GLT-1 promotorunda yer aldığı yapılan CHIP deneyleri ile gösterilmiştir. CHIP analizinde, transkripsiyon faktörlerinin bağlandığı DNA bölgeleri qPCR ile çoğaltılmaktadır. SIRT4 susturulmuş hücre grubunda da CREB, REST ve YY1 transkripsiyon faktörleri GLT-1 promotoruna bağlanmıştır. SIRT4'ün susturulması, CHIP analizinde anlamlı bir fark yaratmamıştır. Sonuç: Bu çalışmada, SIRT4'ün GLT-1'i trankripsiyonel düzeyde regüle ettiği düşünülerek araştırmalar yapılmış ve çeşitli sonuçlar elde edilmiştir. IHA hücrelerinde, SIRT4 geninin susturulması, GLT-1 mRNA seviyesini değiştirmemiştir. SIRT4 geninin susturulmasının, CREB, REST ve YY1 transkripisyon faktörlerinin, GLT-1 promotoruna bağlanmasına etkisi olmamıştır.