HEK293 hücre hattında aşırı ifade ettirilen FOXO3 geninin etkilerinin incelenmesi

Amaç: FOXO proteinleri hücre homeostazı, oksidatif stres yanıtı ve apoptoz gibi fonksiyonların regülasyonunda görev yapan önemli transkripsiyon faktörleridir. Ayrıca FOXO proteinleri tümör baskılayıcılar olarak tanımlanmalarına rağmen, FOXO genlerinin yaptığı translokasyonların kanser oluşumunu desteklediği de gösterilmiştir. FOXO3 geninin MLL geni ile yaptığı translokasyon, ikincil akut lösemi ile ilişkilendirilmiştir. FOXO proteinlerinin kanser oluşumunda rol alması ve belirli hücre tiplerinde FOXO3'ün apoptoz sürecini başlatması nedeniyle bu genin HEK293 hücre hattında yapay olarak aşırı ifade ettirildiğinde, apoptoz mekanizması üzerine etkisi incelenecektir. Yöntem: Çalışmada FOXO3 geni mRNA kodlayıcı dizileri, yüksek gen ifadesi sağlayan aktif promotör barındıran pcDNA3.1 ekspresyon vektörüne PCR klonlama stratejileri kullanılarak takılmıştır. Elde edilen FOXO3/pcDNA3.1 vektörü ile HEK293 hücreleri geçici transfekte edilmiştir. Transfekte hücrelerden protein izolasyonu yapılarak western blot yöntemiyle FOXO3, beta-aktin ve PARP proteinlerine bakılmıştır. Bulgular: HEK293 hücre hattı ile gerçekleştirilen geçici transfeksiyon sonrasında, oluşturduğumuz pcDNA3.1/FOXO3 vektörü barındıran hücre hattının, kontrol hücre hattına göre 1.5 katlık bir FOXO3 ifade artışı gösterdiğini saptadık. Aynı transfeksiyon sonrasında hücre kültürüne herhangi bir apoptotik uyarı vermeden, kendiliğinden bir apoptotik uyarısı oluşturup oluşturmadığını test ettiğimizde ise FOXO3 ile transfekte hücrelerde apoptotik uyarının kontrol hücre hattına göre gerçekleştiğini PARP analizi ile saptadık. Sonuç: Gerçekleştirdiğimiz deneyler sonrasında FOXO3 geninin vektör yardımı ile aşırı ifade ettirilmesinin hücrede apoptozu uyardığını gösterdik.