Cell line
205 theses under this subject heading
Bovine herpesvirüs-1'in farklı kanser hücre hatlarında apoptotik ve otofajik etkilerinin araştırılması
Kanser tedavisinde viroterapi olarak adlandırılan, onkolitik virüslerin kanser hücrelerin yıkımı için kullanımı kanser tedavisinde alternatif bir yol olarak önerilmektedir. Onkolitik virüs, seçici olarak kanser hücrelerinde lizise, apoptozise neden olmakta ve immun sistem hücrelerini uyararak immünoterapiye katkı de sunmaktadır. Çok sayıda virüs bu amaçla aday gösterilirken avantaj ve dezavantajları tüm detaylarıyla yoğun bir şekilde araştırılmaktadır. Yapılan araştırmalarda farklı türlerde patojen olan hastalık etkeni vahşi virüs adaylarının seçilmesi, genetik yapıları üzerinde değişiklikler yapılarak rekombinant formlarının oluşturulması ve kullanımı süreçleri sonrasında bazı virüsleri onkolitik etkisinin önemli olduğunu göstermiştir. Projede önerilen BHV-1 patojen olarak hastalık meydana getirdiği konağı sığırdır. İnsanlarda herhangi bir hastalık etkeni olarak tanımlanmamıştır. Son yıllarda BHV-1 üzerine yapılan bazı araştırmalarda onkolitik potansiyelinin olabileceği önerilmektedir. Bu çalışmada, sığırlarda patojen olan Bovine herpesvirus-1 (BHV-1) 'in farklı kanser hücre hatlarında neden olabileceği ölüm yolaklarından apoptotik ve otofajik onkolitik etkilerinin araştırılması amaçlandı. Bu amaçla, meme kanseri hücre hattı (MDA-MB-231), akciğer hücre hattı (A549), prostat kanseri hücre hatları (DU145 ve PC3) ve servix kanseri hücre hattı (Hela)'nda yapılacak apoptotik ve otofajik yolaklar araştırıldı. Hücre hatları farklı titrelerideki birüs enfeksiyonuna ve zamana bağlı değişiklikler değerlendirildi. Virüsü enfeksiyonuna bağlı miktar ve zamana bağlı hücre kayıplarının arttığı, apoptotik hücre sayısının artığı tespit edildi. Enfekte hücrelerde bazı markırların (BCL-2, ATG7, p62, kaspaz-8 ve kaspaz-9) ekspresyon seviyesinin zamana ve doza bağlı olarak değiştiği değerlendirildi. Bu kanser hücrelerindeki ölüm mekanizmalarının aydınlatılması amacıyla daha fazla apoptotik markırların ve otofajik markırların kullanılması ihtiyaç duyulmaktadır.
L-arjinin ve Agmatinin insan enteroendokrin NCI-H716 hücrelerinde GLP-1 ve PYY salgısı üzerine etkisi: Kalsiyum algılayan reseptörlerin rolü
Agmatin, arjinin dekarboksilaz tarafından L-arjininden üretilen doğal bir poliamin olup yiyeceklerde de bol miktarda bulunmaktadır. Yiyecek alımına bağlı olarak enteroendokrin L hücrelerinden salgılanan glukagon benzeri peptit-1 (GLP-1) ve peptit YY (PYY) hormonlarının en önemli etkileri yemek sonrasında insülin salgısını artırarak, kan glukozunu düzenlemeleridir. Bu çalışmada agmatinin ve L-arjininin GLP-1 ve PYY salgısı üzerine etkisini incelemek için insan enteroendokrin L-hücre hattı olan NCI-H716 hücreleri kullanılmış ve hücreler 20 ve 40 mM olacak şekilde agmatin ve L-arjininin iki farklı konsantrasyonu ile 2 saat süreyle inkübe edilerek GLP-1 ile PYY salgıları ölçülmüştür. Ayrıca hücrelere bu maddelerle birlikte hormon salgısında kalsiyum algılayan reseptörlerin (CaSR) rolünü araştırmak amacıyla sırasıyla CaSR'nin negatif ve pozitif allosterik modülatörleri olan NPS 2143 ve R568 ile kombinasyonları uygulanmıştır. Her ne kadar 20 ve 40 mM'lık agmatin ve L-arjinin dozları tek başlarına GLP-1 ve PYY salgısına yol açmasa da NPS 2143 ile birlikte uygulanmaları GLP-1 ve PYY salgısında azalmaya yol açmıştır. Bu sonuç GLP-1 ve PYY salgısında CaSR'nin aracı reseptör olabileceğini düşündürmüştür. NCI-H716 hücrelerinde GLP-1 ve PYY salgısında hücre içi ikinci mesajcıları belirlemeye yönelik çalışmaların sonucunda 40 mM agmatin + NPS 2143 grubunda cAMP seviyesinde düşüş, 40 mM agmatin + R568 grubunda ise cAMP seviyesinde artış görülmüştür. 40 mM L-arjinin ile hücre içi kalsiyum yoğunluğunun arttığı ve NPS 2143 ile birlikte uygulandığında da azaldığı bulunmuştur. CaSR immünreaktivite şiddeti ise gruplar arasında fark göstermemiştir. Sonuç olarak, insan enteroendokrin L-hücre hattı olan NCI-H716 hücrelerinde agmatin ve L-arjininin 20 ve 40 mM'lık dozları belirgin bir hormon salgısına yol açmazken, NPS 2143 uygulamasına bağlı olarak hem hormon hem de cAMP/kalsiyum düzeylerinde değişiklikler meydana geliyor olması GLP-1 ve PYY salgısında CaSR'lerin rolü olduğu fikrini desteklemektedir.
Investigation of possible protective effects of certain xenobiotics on aluminum toxicity in SH-SY5Y cell line
Aluminum, a neurotoxic metal, is widely present in our daily lives, exposing us extensively. Aluminum exposure is a potential Alzheimer's risk factor, with no cure yet. Researchers are actively seeking new treatments or repurposing existing drugs to fight this challenging condition. This thesis explores metformin, naltrexone, and dihydrolipoic acid's neuroprotective potential on an Alzheimer's disease model (differentiated SH-SY5Y cells exposed to chronic aluminum). It delves into their impact on GSK-3β and Wnt signaling pathways. Results reveal that chronic aluminum exposure triggers oxidative stress, elevates tau protein levels, increases GSK-3β activity, and diminishes Wnt signaling pathway activity. Encouragingly, the studied xenobiotics promise to mitigate these detrimental effects. They effectively reduce tau protein levels, modulate GSK-3β and Akt activity, and restore Wnt signaling pathway functionality. Additionally, these compounds significantly alleviate oxidative stress, highlighting their potential as neuroprotective agents against chronic aluminum exposure in AD. In conclusion, further clinical investigations are essential to establish optimal dosages and treatment strategies. Dihydrolipoic acid may be a dietary supplement, potentially slowing AD progression when added to patient diets. Lower-dose naltrexone shows promise in mitigating neuroinflammation in Alzheimer's, warranting exploration as a novel therapy. Considering Alzheimer's as a metabolic disorder akin to diabetes, metformin emerges as a potential treatment. These findings highlight the need for urgent clinical trials and translational research, offering the potential to reshape AD treatment and provide renewed hope for patients and families.
Investigation of the in vitro and in vivo effects of telomere-targeted new drug candidate compounds on different cancer cell lines
Cancer, characterized by its heterogeneity, metastatic character, and limited treatability, stands as a leading global cause of mortality. Cancer cells elongate their telomeres through the activity of the telomerase enzyme, thereby gaining immortality by evading control checkpoints in the cell cycle. The expression of telomerase is present in approximately 95% of cancer cells, while its activity is absent in somatic cells. Consequently, in recent years telomerase/telomere-targeted therapies have shown significant promise. Due to the heterogeneity of cancer cells and their varying telomere lengths, long-term anti-telomerase therapies can lead to adverse effects. Therefore, there is a need for novel molecules that can target telomeres, regardless of their telomeric lengths, and exhibit rapid efficacy. Within the scope of this doctoral thesis research, the objective was to investigate molecules added to telomeric structures by telomerase, which may induce genomic instability and cell death through telomeric DNA damage, both in vitro and in vivo. These molecules were synthesized by the MAIA biotechnology company (Chicago, USA) and delivered to the Department of Medical Biochemistry. The candidate drug molecules were tested on different cancer cell lines [breast cancer (MCF-7), non-small cell lung cancer (A549), cervical cancer (HeLa), and colon cancer (HT29)] at nine different concentrations for 96 hours, and cytotoxicity was assessed using the MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide) assay. The obtained EC50 results were compared with 6-thio-dG in each cell line, and a molecule named "L6" was identified as a new potential drug candidate with a lower EC50 value compared to 6-thio-dG. The EC50 values of different cell lines to the L6 molecule were evaluated, and HT29 colon cancer cells, which exhibited the highest sensitivity to the L6 molecule, were selected as the target cell line. The DNA damage induced by these molecules at telomeric ends was assessed using the Telomere Induced Foci (TIF) method with confocal microscopy. In this method, co-localization of telomeric probes and staining with the γH2AX antibody specific to DNA damage was used to demonstrate TIF. The results obtained from the TIF method indicate that the telomeric DNA damage caused by the L6 molecule is statistically significant compared to the control group and 6-thio-dG. Additionally, an assessment of global genomic damage reveals that the L6 molecule and 6-thio-dG induce DNA damage to an equal extent. Furthermore, the effects of the candidate molecules on the base excision repair (BER) pathway proteins Apurinic/Apyrimidinic Endonuclease-1 (APE1) and Poly(ADP-ribose) polymerase-1 (PARP1), as well as the quantities of DNA damage product 8-Hydroxy-2'-deoxyguanosine (8-OH-dG) was investigated liquid chromatography-high resolution mass spectrometry (LC-HR/MS) and liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) techniques. L6 promotes a significant downregulation in the expression levels of both PARP1 and APE1 in HT29 cells. The in vivo efficacy of L6 was evaluated both in CD1 nude mice and BALB/c mice. In the xenograft model established with the HT29 cell line, the optimal dosage of L6 was determined to be 3 mg/kg, administered in a total of 4 doses, with a treatment frequency of twice per week. A syngeneic animal model was generated using the CT26 cell line, followed by the administration of sequential therapy with the L6 molecule and anti-PD-L1. After the euthanize the animals, immunophenotyping was performed by flow-cytometry on excised tumor tissues. The results obtained indicate that the L6 molecule led to a reduction in tumor size, decrease in Treg cell count, and an increase in the activated CD8+ cells. Key words: Cancer, telomere, telomerase, TIF (telomeric induced foci), xenograft, syngeneic, LC-MS/MS, APE1, PARP1, 8-OH-dG
Bisfenol A ve türevlerinin toksisitelerinin insan prostat normal hücre hattında değerlendirilmesi
Bisfenol A (BPA), iyi bilinen bir endokrin bozucudur ve plastik endüstrisinde yaygın olarak kullanılır. Son yıllarda, BPA teması ile birlikte erkek üreme sistemi üzerindeki etkilerine yönelik birçok çalışma yapılmıştır. Bu etkilerin ciddi sonuçlara yol açabileceğinin kanıtlanmasının ardından, BPA kullanımı birçok endüstriyel alanda yasaklanmış ve yerini bisfenol F (BPF) ve bisfenol S (BPS) gibi analogları almıştır. Bu tez çalışmasında, BPA ve türevleri olan BPF ve BPS'in sitotoksik etkileri, genotoksik etkileri ve oksidatif strese neden olma potansiyelleri tümörijenik olmayan prostatik hücrelerinde (RWPE-1 hücreleri) karşılaştırılıp değerlendirilmiştir. Ayrıca, bisfenol türevlerinin DNA onarım proteinleri üzerindeki etkileri değerlendirilmiştir. RWPE-1 hücreleri, 0 ila 1000 µM arasında değişen konsantrasyonlarda 24 saat boyunca BPA, BPF ve BPS ile inkübe edilmiştir. BPA, BPF ve BPS için inhibitör konsantrasyon 50 (IC50) değerleri sırasıyla 113,74 μM, 249 μM ve 380,90 μM olarak bulunmuştur. Bu sonuçlar sitotoksisite potansiyellerinin BPA> BPF> BPS olarak sıralandığını göstermiştir. Tüm bisfenol türlerine maruz kalan hücre gruplarında süperoksit dismutaz (SOD), katalaz (CAT), glutatyon peroksidaz (GPx) ve glutatyon redüktaz (GR) aktiviteleri ile glutatyon (GSH) ve total antioksidan seviyelerinde (TAOC) değişiklikler saptanmıştır. Lipit peroksidasyon düzeylerinde bir artış gözlenmemiştir. Standart ve modifiye Comet analizinde tüm bisfenol türevleri kontrol grupları ile karşılaştırıldığında anlamlı düzeyde DNA hasarına yol açmıştır. Bisfenoller ile inkübe edilen tüm gruplarda baz eksizyon onarımında (BER) görev alan proteinlerde, p53 protein düzeylerinde ve DNA onarım proteinlerinde (OGG1, Ape-1 ve MyH) düşüşler saptanmıştır. Elde edilen sonuçlar, BPA türevlerinin de sitotoksik ve genotoksik özelliklerinin olabileceğini düşündürmektedir. Aynı zamanda DNA onarım proteinlerinin de ekspresyonlarını değiştirmektedirler. Bu nedenle bu maddelerin, BPA'ya alternatif olarak güvenle kullanılıp kullanılamayacağını değerlendirmek için daha fazla çalışmaya ihtiyaç bulunmaktadır.
Glioblastoma hücre hatlarında uyarılmış pluripotent kök hücre (UPKH) kaynaklı eksozomların terapötik etkisinin analizi
En ölümcül kanser türleri arasında görülen glioblastoma, sağkalımı oldukça düşük olan bir primer beyin tümörüdür. İlaç direnci ve kan beyin bariyerini geçme zorluğundan dolayı mevcut tedavilerle bile glioblastoma vakalarında sağkalım oldukça düşüktür. Mevcut tedavilerin yanı sıra kan beyin bariyerini kolaylıkla geçebilen ve toksik etki oluşturmayan eksozomlar, GBM tedavisi için umut vaat eden biyolojik bir araçtır. Yapılan daha önceki çalışmalar, embriyonik kök hücre kaynaklı eksozomların glioblastomada antitümörijenik etkilere sahip olduğunu göstermiştir. Bununla birlikte, embriyonik kök hücreler gibi etik problemler teşkil etmeyen uyarılmış pluripotent kök hücrelerden kaynaklanan eksozomların aynı etkiye sahip olup olmadığı bilinmemektedir. Bu nedenle, yapılan bu tez çalışmasında, embriyonik kök hücrelere yakından benzeyen ve sınırsız çoğalma kapasitesine sahip olan uyarılmış pluripotent kök hücre kaynaklı eksozomlar, bir glioblastoma hücre hattı olan LN18 hücrelerinde uygulanmış ve hücre canlılığıyla birlikte GBM-ilişkili bazı genlerin ifadesi analiz edilmiştir. Bunun yanı sıra sınırsız çoğalan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin kullanılmasıyla kaynağa bağlı düşük eksozom verimliliğinin önüne geçilmiştir. Elde edilen verilerle uyarılmış pluripotent kök hücre kaynaklı eksozomların GBM hücre canlılığını azlattığı ve GBM-ilişkili genler üzerinde etki ettiği gözlenmiştir. Haliç Üniversitesi Fen Edebiyat Fakültesi Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü'nün bilimsel araştırma ve uygulama çalışmalarına verdiği destekle gerçekleştirilen bu tez çalışmasının sonuçları, anti-GBM etkisinin olduğu gözlenen uyarılmış pluripotent kök hücre kaynaklı eksozomların, GBM için potansiyel bir terapötik araç olabileceğini göstermektedir.
0-6 aylık anneden alınan anne sütü örneklerinin mide kanseri hücre hattı üzerindeki etkisinin araştırılması
Yenidoğanın beslenmesi tarihsel olarak incelendiğinde, günümüze kadar en önemli besin anne sütüdür. Anne sütü yenidoğan bebeğin optimum büyüme ve gelişmesi için gerekli olan sıvı, enerji ve besin ögelerinin içeren, biyoyararlılığı yüksek, sindirimi kolay bir besindir. Mide kanseri, tüm dünyada görülme insidansı ve ölüm oranı yüksek bir kanser tipidir. Mide kanseri, diyet faktörleri, yeterli ve sağlıklı beslenme, liften zengin diyetler, erken teşhis, genetik faktörler insidansı azaltırken, tütün ürünleri ve alkol tüketiminin fazla olması mide kanseri insidansını arttırmaktadır. Bu çalışmada 0-6 aylık bebeği olan 10 farklı anneden alınan anne sütlerinden elde edilen whey proteinlerinin metastaz üzerine etkisi araştırılmıştır. Anne sütü whey proteinlerinin metastaz üzerindeki hücre göçü deneyi ve çeşitli kanser türlerinde metastaz ile ilişkilendirilen PPARRγ'nın gen ifadesi yoluyla incelenmiştir. Çalışmamızda mide kanseri hücrelerini 37oC ve %5 CO2 şartlarında, RPMI büyüme besiyerinde çoğaltılmıştır. Çoğalan hücreler 12 kuyucuklu hücre kültür tabaklarına 200.000 hücre/kuyu olacak şekilde ekilmiş ve hücrelerin konfluent olmaları sağlanmıştır. Daha sonra her kuyucuğa 50 uL anne sütlerinde elde edilen whey proteinleri uygulanmış ve ardından pipet ucuyla düz bir çizik atılmıştır. Hücre göçünün tespiti amacaıyla mikroskop altında 0.saat ve 24. saatteki görüntüleri kaydedilmiştir. PPARγ gen ifade analizi için hücrelerden total RNA izolasyonu yapılmış ve anne sütü whey proteinlerinin PPARγ üzerindeki etkisi RT-PCR yöntemi ile analiz edilmiştir. Çalışma sonucunda 2., 3., 5. ve 8. anne sütü whey proteinlerinin metastaz baskıladığı ancak 6.,7., 9. ve 10. anne sütü whey proteinlerinin metastazı baskılamadığı tespit edilmiştir. Bununla birlikte 1. ve 4. anne sütü whey proteinlerinin verildiği mide kanseri hücrelerinde kapanma gözlemlenmemiş aksine atılan çiziğin genişliğinde artış olduğu gözlemlenmiştir. 3., 4., 5., 6. ve 7. anne sütü whey proteinlerinin uygulandığı hücrelerde PPARγ gen ifadesi anlamlı şekilde artarken (p<0.05), diğerlerinde gen ifade değişimi anlamlı bulunmamıştır. Sonuç olarak her anne sütünün whey proteini profili farklı olduğundan, anne sütü whey proteinlerinin mide kanserindeki etkisi PPARγ ve farklı metastazik yolaklar ile incelenmelidir.
Sodyum florürün (NAF) böbrek hücre serilerindeki sitotoksik etkisinin araştırılması
Bu çalışma, farklı dozlarda ve zamanlarda alınan hücre örneklerinde, NaF uygulanması ile belirli düzeylerde sitotoksisite oluştuğu belirlenen NRK-52 böbrek hücre serisinde, sitotoksisitenin meydana gelmesinde, apoptotik, otofajik ve nekrotik mekanizmaların olası rollerinin araştırılması amacıyla planlandı. Hücreler, in vitro koşullarda düzenli geçişlerde çoğaltıldı. NaF'nin IC50 değeri MTT ile belirlendi. Hücre numuneleri, hücrelerin IC50 değerlerine göre hazırlanan örneklerden 3, 12 ve 24 saat sonra alındı. Biyokimyasal analizler için, hücreler tripsinizasyon ile toplandı ve donma / çözme metodu ile lize edildi. MRNA manuel yöntemle izole edildi. Apoptotik, otofajik ve nekrotik genler için cDNA elde edildi ve hedef gen DNA, gerçek zamanlı PCR yöntemi ile amplifiye edildi. Bu seçilmiş genlerin ekspresyonu değerlendirilmiş ve NaF kaynaklı moleküler yollarda zamana bağlı olarak önemli değişiklikler tespit edilmiştir. Üçüncü saatte hücrelerin apoptotoik yolağı kullanarak apoptoza girdikleri, 12. saatteki ölümlerin tamamen otofajik yolak kaynaklı olduğu ve 24. saatte ise, otofajide duramayan hücrelerde nekrotik sinyal ve apoptozis yolaklarındaki genler vasıtasıyla, hücre ölümünün tamamlandığı tespit edildi. Sonuç olarak, NRK-52 böbrek hücre serisinde NaF bağımlı hücre ölümlerinde, moleküler mekanizmaların zamana bağlı olarak aktivite gösterdiği belirlendi. NaF eklendikten sonraki 3. Saatten itibaren sitotoksik etki mekanizmalrının harekete geçtiği ve 12 ve 24. Saatlerde farklı mekanizmaların hücre ölümlerini hızlandırdığı kanısına varıldı. Anahtar kelimeler: NaF, böbrek, sitotoksisite, hücre kültürü
Sodyum florür (NAF) uygulanmasının PI3K/AKT sinyal yolağı üzerine etkisinin in vitro olarak araştırılması
Korkmaz R, Sodyum Florür (NaF) uygulanmasının PI3K/AKT sinyal yolağı üzerine Etkisinin in vitro olarak araştırılması. Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Biyokimya (Veteriner) Anabilim Dalı, Yüksek Lisans Tezi, Van, 2020. Bu tez çalışması, yüksek elektronegativiteye sahip flor elementinin neden olduğu hücre içi moleküler mekanizmaların düzenlenmesinde önemli bir role sahip PI3K/AKT yolağına olan etkisini ortaya koymak amacıyla plandı.Bu amaçla, flordan ençok etkilenen dokuların başında böbrek dokusu geldiği için çalışma materyalı olarak NRK-52E rat böbrek epitel hücresi seçildi. Çalışmada flor kaynağı olarak NaF kullanıldı. Uygulanacak NaF konsantrasyonu MTT canlılık testi ile belirlendi. NaF konsantrasyonları 24 saat için proliferasyon artırıcı konsantrasyon olan (10 μM) ve sitotoksik konsatrasyonlar olan IC25 (2250 μM) ve IC50 (4250 μM) olarak belirlendi ve uygulandı. Çalışmada PI3K/AKT yolağında önemli role sahip olan genler ERBB2, PI3K, AKT ve mTOR genleri ile TP53 geni hedef genler olarak düşünüldü. Belirlenen NaF konsantrasyonu hücrelere uygulandı ve 24 saatin sonunda çalışma gruplarında total mRNA izole edildi. Elde edilen mRNA'lar cDNA'ya çevrildi. Elde edilen cDNA'lar kullanılarak hedef genlerin ekspresyon seviyeleri gerçek zamanlı-qPCR yöntemiyle tespit edildi. Çalışma sonunda elde edilen sonuçlara göre düşük konsantrasyonda verilen NaF konsantrasyonun ERBB2, PI3K, AKT genlerini ekspresyonunu artırdığı, yüksek konsantrasyonda ise değiştirmediği tespit edildi. mTOR ise verilen tüm konsantrasyonlarda ekspresyonunun azaldığı ortaya konuldu. TP53 geni ise düşük konsantrayonda değişmediği, yüksek konsantrasyonda ise artış gösterdiği belirlendi. Yapılan çalışmadan elde edilen sonuçlar ve literatürlere göre, florun PI3K/AKT yollağında yer alan kinaz enzimlerini inhibe edebileceği ve bunun sonucunda bazı genlerin ekspresyonunun azalmasına veya artışına neden olabileği sonucuna varılabilir. Özet olarak NRK-52E böbrek epitel hücre serisinde florun neden olduğu hücre hasarının patogenezinde PI3K/AKT/mTOR yolağı önemli bir sinyal yolağıdır
Stafilokokal enterotoksin A (SEA) varlığında akut myeloid lösemi hücre hatlarında karakteristik özelliklerdeki değişimin ve kemoterapiye yanıtın incelenmesi
Kanser hastalarında ortaya çıkan enfeksiyonlar, tümörün kendisi, nötropeni veya uygulanan anti-neoplastik tedavi (sitotoksik, immünosupressif, vb) nedeniyle sık karşılaşılan, ciddi morbidite ve mortaliteye yol açan en önemli komplikasyonlardan biridir. Çocukluk çağı akut lösemilerinin %15'ini ve lösemiden ölümlerin %50'sini oluşturan akut miyeloid lösemide (AML) en sık gözlenen bakteri enfeksiyonlarının başında stafilokokal enfeksiyonlar gelir. Stafilokokus aureus (S. Aureus)'un en etkili toksinlerinden biri olan enterotoksin tip A (SEA), besin zehirlenmesi, toksik şok sendromu, pnömoni ve septik şok benzeri enfeksiyonlara yol açan bir virulans faktörüdür. SEA'nın kanser hücreleri üzerindeki etkileri konusunda bazı çalışmalar olmakla birlikte bu çalışmalar çoğunlukla solid tümörler üzerinde yapılmıştır. SEA'nın kan kanserleri, özellikle akut lösemiler üzerindeki etkisini ve etki mekanizmalarını inceleyen çok az çalışma bulunmaktadır. Bu çalışma, SEA'nın 6 farklı AML ve bir kontrol hücre hattı üzerindeki etkilerini (inhibe/aktive edici etki) ve bu etkilerin moleküler mekanizmalarını araştırmayı; ayrıca SEA'nın klinikte AML'de sıklıkla kullanılan bazı kemoterapötiklere karşı oluşan direnç üzerindeki etkilerini ve bundan sorumlu etki mekanizmasını incelemeyi amaçlamaktadır. SEA'nın AML hücre hatlarındaki etkisi, hücre hatlarında SEA ile muamele sonrasında çoğalma, proliferasyon, transwell göç ve invazyon testleri uygulanarak araştırılacaktır. Ayrıca SEA'nın etkisinden sorumlu olabilecek genlerin ve yolakların belirlenmesi için in siliko analizler yapılacaktır. SEA'nın hücre hatlarının kemoterapötik ilaçlara karşı gösterdiği direnç profillerinin saptanmasında AML tedavisinde sıklıkla kullanılan FDA onaylı idarubicin ve cytarabine ilaçları kullanılacak; SEA'nın AML hücre hatlarının söz konusu ilaçlara olan duyarlılığı veya direnci üzerindeki etkileri hücre canlılık testleriyle tayin edilecektir. Kanser ile birlikte oluşan enfeksiyonların kanser süreçleri ile ilişkisinin moleküler temellerinin anlaşılmasının, özellikle lösemi gibi kanserlerin tedavisine yeni yaklaşımlar getireceğine inanılmaktadır. Söz konusu enfeksiyonların AML'de gelişen ilaç direnci üzerindeki etkileri ve bu etkilerin moleküler mekanizmasının aydınlatılması da önem taşımaktadır. Bu çalışmanın verileri, daha sonra yapılacak in vitro ve in vivo ilaç geliştirme/hedefleme çalışmalarına öncülük edecektir.
Oksidatif stres kaynaklı nöron hasarında antioksidanların koruyucu etkisinin incelenmesi
Sunulan bu tez çalışması kapsamında nöronal bir hücre hattı olan SH-SY5Y insan nöroblastoma hücre hattında, iki boyutlu in vitro oksidatif stres modeli oluşturulması ve bu modelde iki farklı antioksidanın koruyucu etkilerinin incelenmesi hedeflenmiştir. Bu hedef doğrultusunda SH-SY5Y hücreleri kültüre edilmiş ve hidrojen peroksit ile hücrelerde oksidatif stres modeli oluşturulmuştur. Bu model üzerinde artan dozlarda n-asetil sistein ve selenyumun koruyucu etkileri deneysel çalışmalarla incelenmiştir. Antioksidanların hücre canlılığına olan etkileri 24, 48 ve 72. saatlerde yapılan 3-(4,5-dimetiltiyazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazolyum bromür kalorimetrik testi ve akridin/orange propidyum iyodür floresan boyaması ile belirlenmiştir. 72. saatte, hücrelerde oluşan toplam antioksidan ve oksidan kapasite tayini yapılarak oksidatif stres indeksi tespit edilmiştir. Elde edilen sonuçlara göre, n-asetil sistein ve selenyumun belirlenen doz aralıklarında hücreleri oksidatif hasara karşı koruduğu, ancak yüksek dozlarda hücreler için toksik olabilecekleri belirlenmiştir. 24, 48 ve 72 saatlik uygulamalarda hidrojen peroksit hücre canlılığında önemli ölçüde azalmaya sebep olurken, hidrojen peroksit uygulaması öncesinde n-asetil sistein ve selenyum uygulanan gruplarda hücre canlılığı anlamlı derecede yüksek bulunmuştur. Toplam antioksidan ve oksidan kapasitesi tayinleri sonucu elde edilen oksidatif stres indekslerinde hidrojen peroksit uygulanan grubun en yüksek oksidatif strese sahip olduğu, antioksidan uygulanan gruplarda ise oksidatif stresin daha düşük olduğu tespit edilmiştir. Selenyum ve n-asetil sistein koruyucu etkileri arasında ise anlamlı bir farklılık bulunmamıştır. Bu doğrultuda, n-asetil sistein ve selenyumun oksidatif stres kaynaklı nörodejenerasyonda koruyucu olabileceği sonucuna ulaşılmıştır. Bununla birlikte, gelecekte yapılacak olan kapsamlı in vitro ve in vivo çalışmalarla bu sonucun desteklenmesi sayesinde bu iki antioksidan molekülün etkileri çok daha iyi anlaşılmış olacaktır.
İnsan makrofajlarında nitrik oksit sentaz 2 (NOS2) ifade ve aktivitesinin bazal benzeri meme kanseri hücrelerinden üretilen faktörler varlığında incelenmesi
Makrofajlar patojenlere karşı immün cevapta doğal immünitenin önde gelen hücreleridir ve kazanılmış bağışıklık cevaplarının düzenlenmesinde rol alırlar. Mikrobisidal özelliğe sahip makrofajlar LPS gibi bakteriyel ürünler, IFN-γ veya TNF-α gibi sitokinlerle uyarılarak proinflamatuvar cevabı ilerletirler. Nitrik oksit (NO) ve reaktif oksijen türleri (ROT) üretimi anti-mikrobiyal yanıtların biyokimyasal mekanizmasında elzemdir. NO üretimi nitrik oksit sentaz (NOS) enzimleri tarafından sağlanır. Uyarılabilir NOS izoformu (NOS2)'nin fare makrofajlarındaki varlığı pek çok çalışma ile kanıtlanmışken, insanlarda NOS2 ifadesine ve NO üretim düzeyine dair pek çok çelişkili yayın bulunmaktadır. Bu tez çalışması, monosit-makrofaj dönüşümü sırasında bazal-benzeri meme kanseri hücrelerinden üretilen faktörlerin miyeloid hücrelerin geçirdiği aktivasyon ve farklılaşma süreçleri sırasında NOS2 ifadesini ve NO değiştirebilmesi hipotezine dayanmaktadır. Bu amaçla, THP-1 monositik hücre hattı, bazal-benzeri meme kanseri hücre hattı süpernatanları varlığında makrofaj yönünde farklılaştırıldı ve lipopolisakarit (LPS) ve interferon (IFN)-γ ile uyarıldı. Hücrelerde fenotipik (CD14, TLR4, MD2, CD40, CD11c ve IFNγR), fonksiyonel (ROT ve NO üretimi) ve morfolojik (May-Grünwald Giemsa, aktin hücre iskeleti boyaması) farklılaşma parametreleri incelendi. Ayrıca, THP-1 hücrelerinin bu koşullarda farklılaştırılması sırasında fibronektin ve Matrijel kaplı yüzeyler ile de deneyler gerçekleştirildi. Bu koşullar altında NOS2 ifade düzeyi mRNA ve protein düzeyinde araştırıldı. Fare kökenli makrofaj ve meme kanseri hücreleri varlığında ve ek olarak kullanılan insan hücre hatları süparnatanları varlığında doğrulama deneyleri gerçekleştirildi. İnsan bazal-benzeri meme kanseri hücre hattı prototipi olarak kullanılan MDA-MB-231 hücrelerinden salgılanan faktörler varlığında farklılaştırılan THP-1 hücrelerinde ROS ve NO üretiminin moldüle olduğu belirlendi. Kanser süpernatanları varlığında LPS'nin etkisinin sınırlanabildiği ancak IFN-γ'nın daha belirgin etkisi olduğu izlendi. İnsan NOS2 düzeylerinin meme kanseri süpernatanları varlığında olumsuz etkilendiği ve bunun NO üretimine de yansıdığı belirlendi. Elde edilen bulgular, özellikle kanser hücresinden salgılanan faktörler varlığında insan NOS2 ifadesinin ve dolayısı ile NO üretiminin monosit-makrofaj faklılaşma derecesine bağlı olarak transkripsiyon-translasyonel düzeylerde düzenlenebileceğine işaret etmektedir.
Klorofilinin meme kanseri kaynaklı metastaz üzerine etkilerinin araştırılması
Kemoterapik ajanlara karşı ilaç direnci gelişmesi, meme kanseri tedavisinde başarıyı düşüren ana nedenlerden birisidir. Çeşitli kanser hücre hatlarında, Glutatyon S-transferaz enzim ailesine ait Glutatyon S-transferaz P1'in ekspresyon düzeylerinin arttığı ve kemoterapiye karşı ilaç direnci gelişiminde rol oynadığı bildirilmektedir. Antioksidan klorofilinin, GSTP1 üzerinde inhibisyon etkisi olduğu bilinmektedir. Meme kanseri tedavisinde başarıyı düşüren ve mortaliteye sebep olan diğer ana etmen, özellikle üçlü negatif meme kanserlerinde uzak doku metastazı görülmesidir. Bu çalışmada, antioksidan ve GSTP1 inhibitörü olan klorofilinin, üçlü negatif meme kanseri metastazı üzerindeki etkisinin araştırılması hedeflenmiştir. Bu amaç doğrultusunda, 4T1 meme kanseri hücre hattında ve oluşturulan meme kanseri hayvan modelinde, kanser ilacı olan dosetaksel ve/veya klorofilinin etkinliği in vivo/in vitro olarak araştırıldı. Bunun için, klorofilinin ve dosetakselin hem tekli olarak hem de kombine uygulanmasının 4T1 hücre hattında hücre canlılığı, hücre döngüsü ve hücre migrasyonu üzerine etkileri araştırıldı. Hücre ve doku lizatlarında MMP-9 ekspresyonu, total jelatinaz aktivitesi araştırıldı. Karaciğer doku lizatlarında total GST aktivitesi ve glutatyon düzeyleri araştırıldı. Karaciğer doku kesitlerinde mikrometastazlar araştırıldı. Sonuç olarak; klorofilin ve dosetakselin birlikte uygulanmasının migrasyonu in vitro olarak önemli ölçüde inhibe ettiği tespit edildi (p<0,01). Klorofilinin tekli uygulanmasının dokularda MMP-9 ekspresyonunu önemli ölçüde azalttığı, dosetaksel ile birlikte uygulandığında bu etkinin daha yüksek düzeylerde olduğu gözlemlendi (p<0,05). Kombine tedavi uygulanan grupta, in vivo analiz edilen toplam jelatinaz aktivitesinde de anlamlı bir azalma gözlemlendi (p<0,01). Klorofilin bileşiği uygulanan grupta in vivo olarak total glutatyon (GSH) düzeylerinin arttığı, Glutatyon S-transferaz (GST) enzim aktivitesinin azaldığı tespit edildi (p<0,05). Kombine tedavi uygulanan grupta karaciğer dokularındaki mikrometastatik lezyonların azaldığı bulundu. Çalışmanın sonucunda, klorofilin ve dosetakselin birlikte uygulanmasının metastazdaki ana süreçlerden olan migrasyon ve jelatinaz enzim ekspresyonu/aktivitesi ile karakterize olan invazyon basamağını inhibe ettiği, dolayısıyla metastatik süreçlerin kontrolünde potansiyel bir role sahip olabileceği sonucuna varılmıştır.
Serviks skuamöz hücreli kanser hücre serilerinde sisplatin ile eş zamanlı radyoterapiye eklenen metformin'in radyoduyarlılaştırıcı rolünün araştırılması
Serviks kanseri tedavisi sürecinde çeşitli mekanizmalarla radyoterapi (RT) ve sisplatine karşı direnç gelişmektedir. Metforminin kanser hücreleri üzerinde antiproliferatif etkisi olduğunu ve RT ile birlikte uygulandığında radyoduyarlılığı arttırdığını gösteren çalışmalar olsa da serviks kanserinde RT ile eş zamanlı sisplatin uygulamasına metformin eklendiğinde tümör kontrolünün artıp artmadığı ile ilgili veri bulunmamaktadır. Bu amaçla, insan serviks kanseri hücre dizisi HeLa hücrelerinde metforminin tek başına radyoduyarlılaştırıcı etkisi, sisplatin ile eş zamanlı uygulamasındaki etkisi ve 5' adenozin monofosfat (AMP) ile aktive edilen protein kinaz (AMPK) aktivasyonu/inhibisyonu ile radyoduyarlılığın değişip değişmediği bu çalışmada araştırılmıştır. Metforminin iyonizan radyasyon varlığında sisplatin sitotoksisitesini arttırmadığı gösterilmiştir (sisplatin ile kıyaslandığında, p>0.05). Özellikle yüksek iyonizan radyasyon dozlarında sisplatinin radyoduyarlılaştırıcı etkinliğinin azaldığı gösterilmiştir. Yüksek iyonizan radyasyon dozunda hem sisplatin hem de metformin tek başlarına radyoduyarlılaştırıcı etkileri devam etmesine rağmen (hem sisplatin hem de metformin kontrol ile kıyaslandığında, p<0.01) sisplatine metformin eklenmesi radyoduyarlılığı arttırmamaktadır (sisplatin ile kıyaslandığında, p>0.05). AMPK inhibitörü olan dorsomorfinin tüm iyonizan radyasyon dozlarında sisplatinin etkinliğini arttırarak AMPK aktivatörü olan A769662 ve metforminden daha potent bir radyoduyarlılaştırıcı ajan olduğu gösterilmiştir. A769662'nin sisplatinden 24 saat önce uygulanması ile hücre içinde artan AMPK'nın sisplatine direnç oluşturduğu, ancak eş zamanlı uygulamada bu etkinin gözlenmediği görülmüştür. Metformin, sisplatin, A769662 ve dorsomorfinin iyonizan radyasyona duyarlılık üzerine etkileri hücre hasar ve hasar tamiri proteinleri ve hücre siklus duraklaması incelenerek desteklenmiştir.
Polimer temelli katalitik nanomotorların hazırlanması ve uygulamaları
Sentetik nanomotorlar ya da diğer bir deyişle nanomakineler enerjiyi harekete çevirme kabiliyetine sahip moleküler veya nano ölçekteki yapılardır. Hareket özelliğine sahip olan bu yapılar, istenilen özelliklerin sağlanabilmesi adına boyut olarak büyütülebilir ve bu nedenden ötürü nanomotor veya mikromotor adlandırmaları sıklıkla karşımıza çıkmaktadır. Nanoteknoloji alanındaki hızlı gelişmelerin sonucu olarak çok küçük ölçekli motor yapılarının sentezi (üretimi veya fabrikasyonu) ve uygulamaları oldukça ilgi çekici konulardan biri olmuştur. Biyomedikal alan, görüntüleme teknolojileri, nanotıp, nano ölçekli taşıma, çevre ve akışkan sistemler gibi farklı alanlarda nanomotorların kullanımı söz konusudur. Bu özel yapılar hareket mekanizmaları temel alınarak genel olarak Katalitik (Yakıtlı) ve Yakıtsız Nanomotorlar olmak üzere iki ana sınıfa ayrılmaktadırlar. Sentetik nanomotorlar arasında kimyasal bir yakıt varlığında hareket ettirilen yapılar oldukça yoğun çalışılmaktadır. Bu grup nanomotorlar yüksek hızlara sahip olup düşük derişimlerdeki yakıt varlığında hareket edebilirler. Bu tez çalışması kapsamında iletken polimer temelli katalik nanomotorların sentezi ve uygulamaları gerçekleştirilmiştir. Sentezlenen nanomotorların dış katmanları poli(3,4-etilendioksitiyofen) (PEDOT)/poli(3,4-etilendioksitiyofen) karboksilik asit (PEDOT-COOH) ve polipirol (PPy)/poli(pirol-3-karboksilik asit) (PPy-COOH) kopolimerlerinden oluşmaktadır. Membran-kalıp tekniğine göre elektrokimyasal yöntemlerle hazırlanan nanomotorlar sonrasında antikor (antiHER2) ile immobilize edilmiş ve bu antikor yüklü nanomotorların meme kanseri hücre hattını (MCF-7) tanıma kapasitesi araştırılmıştır. Sentezlenen polimerik nanomotorların karakterizasyon çalışmaları taramalı elektron mikroskobu (SEM), enerji dağılımlı X-ışını spektroskopisi (EDX) ve elektrokimyasal empedans spektroskopisi (EIS) ile gerçekleştirilmiştir. Ayrıca, bu nanoyapıların karbon bazlı elektrot yüzeyine modifikasyonu sağlanmış ve durgun halde meme kanseri hücre hattı ile etkileşimi elektrokimyasal yöntem (EIS) ile de incelenmiştir. Ortaya çıkarılan polimer temelli katalitik nanomotorların biyomedikal alanda mevcut yöntemlere alternatif olabileceği düşünülmektedir. Anahtar Kelimeler: Nanomotor, Katalitik Nanomotor, Elektrokimyasal Depozisyon, Kanser, Meme Kanseri, Meme Kanseri Hücre Hattı
Bisfenol A'nın HepG2 hücrelerine olan etkilerinin incelenmesi
Bu çalışmada, Bisfenol A (BPA) ve Fulvestrant (ICI) kimyasalının HepG2 insan hepatoma hücrelerine uygulanarak hücrelerdeki proliferasyon, yara iyileşmesi, E-kaderin, N-kaderin, vimentin proteinleri ve apoptoza (kaspaz 3/7) etkisinin belirlenmesi amaçlanmıştır. BPA endüstride sıklıkla kullanılan bir endokrin bozucu maddedir ve östrojen benzeri etkiye sahiptir. Fulvestrant, östrojen reseptör antagonistidir. BPA, ICI, BPA ve ICI kombinasyonu uygulanmış HepG2 hücrelerinde yüzde hücre canlılığı MTT deneyi ile belirlenmiştir. BPA ve ICI kombinasyonun HepG2 hücre canlılığı üzerindeki etkileri Talalay-Chou metoduna göre değerlendirilmiştir. HepG2 hücrelerindeki migrasyon yara iyileşme yöntemiyle belirlenmiştir. Hücrelerdeki E-kaderin, N-kaderin ve vimentin protein düzeyleri Elisa kitiyle ölçülmüştür. HepG2 hücrelerinde apoptoz ApoTox-Glo ™ Tripleks Testiyle ölçülmüştür. HepG2 hücrelerine uygulanan 8 nM BPA'nın hücre canlılığını arttırdığı,160 nM ICI ile BPA ve ICI kombinasyon uygulamasının hücre canlılığını azalttığı gözlenmiştir. Talalay-Chou metoduyla, HepG2 hücre canlılığına karşı BPA ve ICI kombinasyonu sonucu gözlenen etkinin sinerjistik bir etkileşimden kaynaklandığı açıklanmıştır. Ayrıca BPA'nın ICI'nın sitotoksik etkisini arttırdığı belirlenmiştir. Yara oluşturulmuş HepG2 hücrelerinde, BPA ile BPA ve ICI kombinasyon uygulamasında % yara büyüklüğünün azaldığı gözlenmiştir.HepG2 hücrelerinde E-kaderin protein düzeyi BPA ve ICI kombinasyon uygulamasında azalmıştır. N-kaderin protein düzeyi ICI ile BPA ve ICI kombinasyon uygulamasında artmıştır. Vimentin protein düzeyinde değişiklik gözlenmemiştir. Apoptoz lüminesans verileri değerlendirildiğinde BPA ve ICI kombinasyon uygulamasının apoptozu arttığı belirlenmiştir ve BPA uygulamasının nekroptozu etkilediği görülmüştür. Bu tez çalışmanın sonuçları HepG2 hücrelerine 8 nM BPA ve 160 nM ICI uygulanmasının hücrelerdeki proliferasyonu, yara iyileşmesini ve apoptozu etkilediği açıklanmaktadır. Anahtar kelimeler: Bisfenol A, epitelyal mezenkimal geçiş, HepG2, E-kaderin, vimentin Bu tez Hacettepe Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Koordinasyon Birimince desteklenmiştir. Proje No: 17804
Dibutil ftalatın insan akciğer hücre hattına olası toksik etkilerinin değerlendirilmesi ve askorbik asit ve N-asetilsisteinin olası koruyucu etkileri
Endokrin bozucular, hormonları taklit ederek veya engelleyerek vücudun normal işleyişini bozan ve genellikle de insanlar tarafından üretilen kimyasal maddelerdir. Üzerinde en çok çalışılan ftalat türevi di(2-etilhekzil) ftalat (DEHP)'tır. DEHP'nin özellikle testiküler ve hepatik oksidatif strese yol açtığı bilinmektedir. DEHP'den sonra en yaygın kullanılan ftalat türevi olan dibutilftalat (DBP) ise, başta kozmetikler (özellikle ojeler) olmak üzere, endüstride birçok alanda yaygın kullanılmaktadır. DBP'ye inhalasyonla da özellikle manikürcülerin, yoğun parfüm ve deodorant kullanan bireylerin ve bu ftalatı üreten işyerlerinde çalışanların maruz kaldığı bilinmektedir. Literatürde DBP'nin testiküler ve hepatik toksisitesine dair veriler olmakla birlikte, akciğer toksisitesi üzerinde çok az sayıda çalışma bulunmaktadır. Ayrıca, DBP'nin akciğer toksisite mekanizmaları bilinmemektedir. Bu tez kapsamında, DBP'nin insan küçük hücreli olmayan akciğer kanseri hücre kültürleri (A549 hücreleri) üzerinde olası sitotoksik ve oksidatif stres oluşturucu etkilerinin değerlendirilmesi amaçlanmıştır. Bu kapsamda, A549 hücrelerinde DBP'nin inhibitör konsantrasyon 30 (IC30; hücrelerin %30'unu öldüren konsantrasyon) ve inhibitör konsantrasyon 50 (IC50; hücrelerin %50'sini öldüren konsantrasyon) dozları belirlenmiş, IC30 dozunun neden olduğu intraselüler reaktif oksijen türlerini (ROS) arttırıcı etkisi değerlendirilmiştir. Ayrıca, DBP'nin yol açtığı olası lipit peroksidasyon ve protein oksidasyonu incelenmiş, organizmadaki en önemli tiyol olan glutatyon (GSH) ve total antioksidan kapasitede (TAOC) düzeylerinde yol açabileceği olası değişiklikler belirlenmiştir. Tez çalışmasında DBP'nin olası toksik etkilerine karşı askorbik asit (Asc) ve N-asetil sisteinin (NAC) olası koruyucu etkileri incelenmiştir. Hem NAC, hem de Asc'nin DBP uygulamasıyla beraber ROS düzeylerini düşürdüğü, protein oksidasyonunu azalttığı, total GSH düzeylerini kontrol düzeylerine yükselttiği ve azalan oksidatif strese bağlı olarak her iki antioksidanın da TAOC düzeylerini düşürdüğü belirlenmiştir. Tez çalışmasından elde edilen bilgiler doğrultusunda, DBP'nin toksik etki mekanizmasının altında yatan nedenlerden birinin oksidatif stres olduğu anlaşılmıştır. Ayrıca, Asc ve NAC'ın DBP'nin neden olduğu oksidatif strese karşı koruyucu oldukları saptanmıştır
Uvea melanomu hücre dizilerinde AMPK modülasyonunun hücre proliferasyonuna etkisinin incelenmesi
Bu çalışma ile, AMPK (AMP Aktive Edici Protein Kinaz) aktivasyonu ve inhibisyonu sonucunda uvea melanomu hücre dizilerinin hücre proliferasyonu yanıtı incelenerek AMPK hedefine yönelik doğru stratejinin karşılaştırmalı olarak belirlenmesi amaçlanmıştır. Uvea melanomu en sık görülen intraoküler primer malign tümördür. AMPK, sağlıklı hücrenin kanser hücresine dönüşümünde ve tümör gelişiminde metabolik adaptasyonu sağlayarak önemli rol oynamaktadır. AMPK farklı koşullarda tümör supresör veya protümoral etki gösterebilmektedir. Çalışmamızda MEL, OMM2.5, 92.1 ve MP46 uvea melanomu hücre dizileri farklı dozlarda AMPK aktivatör (A-769662) ve inhibitör (Dorsomorfin) ajanları ile ayrı olarak inkübe edilmiştir. MTT hücre proliferasyon deneylerinde hücre dizilerinin 24 saatlik proliferasyon hızları sırasıyla en hızlı prolifere olan 92.1 olmak üzere MP46, OMM2.5, MEL270 şeklinde bulunmuştur. Hücrelerin proliferasyon hızları ve farklı ilaç gruplarına verdikleri proliferasyon yanıtları arasında ilişki gözlenmemiştir. Hücre dizilerinin AMPK düzenleyici ajanlara verdiği yanıt 48 saatlik ilaç inkübasyonu sonrasında XTT hücre proliferasyon deneyi yapılarak saptanmıştır. Tüm hücre dizilerinin (92.1 hücre dizisi, <50 μM AMPK aktivatörü dışında) AMPK aktivatörüne verdiği yanıt aynı hücre dizisinin ilaç eklenmemiş kontrol grubu ile karşılaştırıldığında hücre proliferasyonunda azalma olduğu gözlenmiştir. Aynı hücre dizisinde hücre proliferasyonundaki azalma miktarı ve doz artışı arasında bir ilişki gözlenmemiştir. MP46 hücre dizisinde AMPK aktivatörünün 50 μM üzerindeki uygulamalarında artan ilaç dozlarında hücre proliferasyonunun daha fazla olduğu saptanmıştır. Tüm hücre dizilerinin 5 μM üzerindeki AMPK inhibitörünün artan dozlarda uygulanmasına verdiği yanıt, doz arttıkça proliferasyonun daha da azalması olarak gözlenmiştir.
Yeni sentezlenen antitirozinaz aktiviteye sahip kojik asit türevlerinin A375 malin melanoma hücre hattında sitotoksisite ve hücre ölümü üzerine etkisinin aydınlatılması
Bu tez çalışması kapsamında, tirozinaz inhibitörü olan kojik asit türevi bileşikler incelenmiştir. A375 insan malign melanoma hücrelerine karşı sitotoksik özelliği en kuvvetli bileşiğin malign melanoma hücresini hangi mekanizmalarla ölüme götürdüğü ve hücre içerisinde hangi moleküler ölüm yolaklarını tetiklediği araştırılmıştır. Sitotoksisite için yapılan SRB deneyi sonucunda IC50 değeri 9,81 μM olarak ölçülen Bileşik-15'in canlı hücreleri etkili bir biçimde ölüme götürdüğü gözlemlenmiştir. Bileşik-15'in tirozinaz inhibisyonu etkinliği için B16F10 hücrelerinin sitozolü ve kontrol olarak kojik asit kullanılarak spektrofotometrik olarak belirlenmiştir ve çıkan sonuçlarda kojik asitle yarışabileceği gözlemlenmiştir. Kojik asite ait IC50 değeri 59,20 μM iken Bileşik-15'in IC50 değeri 76,69 μM'dır. Ardından, apoptoz deneyi yapılmıştır, deney sonucunda Bileşik-15'in hücreleri apoptozun son aşamasına kadar götürdüğü gözlemlenmiştir. Bileşik-15'in A375 hücrelerinde hangi apoptotik genleri etkilediğini tespit etmek için hücrelerden RNA saflaştırılmış, ardından cDNA oluşturulmuştur. Apoptotik p53 ve Bax, anti-apoptotik Bcl-2 ve ayrıca Jnk, Mdm2 ve Mdr1 gen düzeyleri incelenmiştir. Bcl-2'nin kontrole kıyasla 0,5 kat azalması ve Bax'ın kontrole kıyasla 2,4 kat artması ile Bileşik-15'in hücreleri 24 saatte apoptoza götürdüğü gözlemlenmiştir. p53'ün aktivitesini erkenden gösterdiği Mdm2'nin oranın p53'e göre 3 kat yüksek olması hücrelerde yükselmiş olan p53 seviyesinin kontrol altına alınmış olabileceğini desteklemiştir. Mdr-1 geni için ilk 24 saatte gördüğümüz tepkinin yüksek olduğu görülmüştür. Jnk geni için herhangi bir değişiklik gözlemlenmemiştir. Bileşik-15'in melanoma hücrelerinde tetiklediği ölüm yolağı akış sitometrisi ile belirlenmiş ve çalışmadan elde edilen sonuçlara göre geç apoptoz oranının %58.8 olması A375 hücrelerinin programlı bir şekilde ölüme gittiği söylenebilir. A375 hücrelerinde yapılan western blot analizi ile β-Aktin, P53 ve Mdr1 proteinleri için yapılan analizlerin sonucunda bulguların gen ekspresiyon sonuçları ile tutarlı olduğu gözlemlenmiştir.doldurulacaktır.
Hepg2, CACO-2 ve HT-29 kanser hücrelerinde 2D jel elektroforez ve MALDI-TOF/TOF-MS ile ankaferd hemostat' ın in-vitro antineoplastik etkisinin proteomik açıdan araştırılması
Yaşam bilimlerinde çığır açan keşiflerden biri insan genom projesinin tamamlanmasıyla gerçekleştirilmiştir. Ancak tüm genom haritasının oluşturulması, bilim adamları için zorlu bir görevi de beraberinde getirmiştir. Bu görev insan proteomunun karakterizasyonudur. Proteomik araştırmalar, moleküler seviyede değişim gösteren proteomların analizinin yapıldığı çalışmalardır. Onkoproteomik, kanser hücresindeki protein etkileşimlerini içeren proteomik teknolojilerin kullanıldığı proteomiklerin bir koludur. Kanser patogenezinin daha iyi anlaşılmasını sağlamak, tanı için yeni tümör biyobelirteçleri geliştirmek ve örneklerin proteom profili kullanılarak erken tespit ve teşhisi sağlamak için onkoproteomik çalışmalar yapılmaktadır. Bu tez çalışması kapsamında, Caco-2 ve HT-29 kolon kanseri ve HepG2 karaciğer kanseri hücre hatları, Ankaferd Hemostat (ABS; Ankaferd Blood Stopper®) ile farklı sürelerde muamele edilmiştir. ABS ile muamele edilen hücreler (işlenmiş, T grubu) ve muamele edilmeyen hücreler (kontrol, C grubu) üzerinde karşılaştırmalı proteomik çalışmalar yapılmıştır. Proteomik çalışmalarda, 2 boyutlu jel elektroforezle ayrılan C ve T gruplarına ait proteinler için imaj analizi çalışmaları yapılmıştır. C ve T grupları karşılaştırıldığında, nicel anlamda en az 2 kat farklılaşan proteinler, MALDI-TOF/TOF-MS ile analiz edilmiş ve peptid dizileme çalışmalarıyla tanımlanmıştır. Tanımlanan proteinler Uniprot ve SwissProt gibi veri tabanlarında taranıp yapıları, fonksiyonları, gen adları ve protein-protein etkileşimleri belirlenmiştir. String veri tabanı aracılığıyla da ABS' nin, kanser hücrelerinde etkilediği biyolojik süreçler ve yolaklar tespit edilmiştir. Anahtar Kelimeler: Proteomik, Kolon kanseri, Karaciğer kanseri, İki boyutlu (2D) jel elektroforez, MALDI-TOF/TOF-MS, Protein etkileşimleri, Ankaferd Hemostat. Bu tez çalışması 114S500 no' lu TUBİTAK projesi ve 17656 no'lu Hacettepe BAB Projesi tarafından desteklenmiştir.
Tiroid hücrelerinde bisfenol a'nın toksik etkileri ve selenyum bileşiklerinin koruyucu rolünün değerlendirilmesi
Bisfenol A (BPA) polikarbonatların ve epoksi reçinelerinin üretiminde kullanılan bir kimyasal maddedir. İnsanlar, bu maddeye gündelik yaşamda oral, inhalasyon ve dermal yolla yaygın olarak maruz kalır. Östrojenik etkileri olduğu; endokrin bozucu bir madde olarak değerlendirildiği bildirilmektedir. Son yıllarda yapılan çalışmalarda BPA'nın tiroid bezinin homeostazını ve tiroid hormon üretimini etkileyebildiği ve tiroid hormon reseptörleriyle etkileşebildiği belirlenmiştir. Tiroid, birim ağırlık başına böbrekle birlikte selenyum içeriği en yüksek olan dokudur. Selenyum başlıca diyetle alınan esansiyel bir eser elementtir. Tiroid hormon sentezinde görev alan deiyodinazların yapısında bulunur. Ayrıca, yapısında bulunduğu antioksidan selenoproteinler ile tiroid bezini oksidatif strese karşı korur. Organik ve inorganik formdaki selenyum bileşiklerinin fizyolojik dozlarda alımı, organizmada birçok kimyasalın oluşturduğu zararlı etkilere karşı koruyucu olabilir. Sunulan bu tez çalışmasında, BPA'nın insan papiller tiroid kanseri hücre hattı (B-CPAP) üzerindeki toksik etkileri ve BPA toksisitesi üzerinde selenyumun suplemantasyonunun modifiye edici etkilerinin belirlenmesi amaçlanmıştır. BPA'nın B-CPAP hücrelerinde oluşturduğu sitopatolojik değişiklikler, sitototoksisite, oksidan/antioksidan parametreler ve apoptoz değerlendirilmiş; BPA ile birlikte inorganik selenyum (sodyum selenit, SS) ve organik selenyum (selenometionin, SM) uygulamasının olası koruyucu rolü belirlenmiştir. Elde edilen bulgular, BPA'nın B-CPAP hücrelerinde oksidatif stres oluşumuna, hücre içi ROS düzeylerinde ve lipit peroksidasyonda artışa ve total glutatyon (GSH) düzeylerinde azalmaya yol açtığını göstermektedir. Ayrıca, BPA'nın bu hücrelerde sitopatolojik değişimlere ve apoptoza neden olduğu belirlenmiştir. Selenyum bileşiklerinin ise, bu hücrelerde BPA ile indüklenen sitopatolojik değişikleri, oksidan/antiosidan statü değişimlerini ve apoptozu azaltabileceği yönünde bulgular elde edilmiştir. BPA'nın B-CPAP hücrelerinde yol açtığı oksidatif stresin, bu hücrelerde BPA toksisitesi altında yatan mekanizmalardan biri olduğu sonucuna varılmıştır. İnorganik ve organik selenyum bileşiklerinin ise, tiroid hücrelerinde antioksidan işlevleriyle BPA toksisitesine karşı kısmi olarak koruyucu etkilerinin olabileceği gözlenmiştir. Anahtar kelimeler: Bisfenol A, selenyum, oksidatif stres, apoptoz, B-CPAP hücre hattı
Metabolomik ve fluksomik çalışmalar ile kolon kanserinde kemoterapötiklere karşı direncin in vitro değerlendirilmesi
Günümüzdeki yenilikçi teknolojiler sayesinde omiks (genomik, transkriptomik, proteomik, metabolomik ve fluksomik) gibi karmaşık analizler yapılabilmektedir. Omik analizlerden elde edilen detaylı bilgi; hastalıkların mekanizmasını anlamak, erken teşhisini kolaylaştırmak, bireysel tedavi stratejilerini seçmek ve bunların etkinliğini değerlendirmek için büyük bir potansiyele sahiptir. Metabolomik fenotipinin belirlenebilmesi için çok sayıdaki metabolitin eş zamanlı ve kapsamlı analizlerinin yanı sıra döngü hızlarının da belirlenmesini gerektirir. Tez çalışmaları kapsamında kolorektal kanseri in-vitro modeli olan insan kolon adenokarsinom hücre hatlarına (Caco-2) ve kontrol olan insan fötal kolon hücre hatlarının (FHC) kematöratpotiklere karşı gözlenen direnç gelişimine bağlı olarak fenotipde gözlenen değişimler metabolomik, lipidomik ve fluksomik analizler ile incelenmiştir. Fluksomik analizlerde kararlı 18O izotopu işaretleme ajanı olarak kullanılmıştır. Metabolomik, lipidomik ve fluksomik analizlerin gerçekleştirilmesinde GC-MS ve LC-qTOF-MS analitik cihazları kullanılmıştır. Bu analizler sonucunda 300'ün üzerinde metabolit/lipit ve 38 metabolitin 18O işaretlenme yüzdeleri hesaplanmıştır. Tez kapsamında ilk kez 18O kararlı izotopu ile Krebs döngüsü metabolitleri, aminoasitler, yağ asitleri ve oligofosfonükleotitlerin işaretlenme yüzdeleri belirlenmiştir. İstatiksel olarak anlamlı bulunan metabolitler ile gerçekleştirilen yolak analizlerinde malat-aspartat mekiği, aminoasit, amonyak metabolizmaları ile glikoz-alanin ve üre döngülerine ait yolakların dirence bağlı olarak değiştiği gözlemlenmiştir. Elde edilen kapsamlı omiks (metabolomiks, lipidomiks ve fluksomiks) verileri, kemoterapötiklere karşı izlenen direncin hücre dinamiklerindeki farklılıklarını göstermiştir.
Ankaferd hemostat' ın mcf-7 meme kanseri hücre hattına etkisinin proteomik analizlerle incelenmesi
Günümüzde tedavisi en zor olan ve ölümcül hastalıkların başında gelen kanserle ilgili çok sayıda araştırma gerçekleştirilmektedir. Bu araştırmalardan biri olan omik tekniklerden proteomik analizler; kanser, protein düzeyinde incelenerek kanser hastalığının oluşum mekanizması, teşhis ve tedavisi ile ilgili mevcut klinik çalışmalara destek olunmasının yanı sıra yeni alternatiflere ışık tutmaktadır. Bu tez çalışması, MCF-7 meme kanseri hücre hattının Ankaferd Hemostat (ABS; Ankaferd Blood Stopper®) ile farklı sürelerde muamele edilmesi sonucunda, ABS ile muamele edilmemiş (kontrol, C grubu) ve ABS ile muamele edilmiş hücrelerde (işlenmiş, T grubu) gerçekleştirilen karşılaştırmalı proteomik çalışmalar yapılmıştır. Böylece ABS' nin etkisi, MCF-7 meme kanseri hücre hattına in vitro olarak uygulandıktan sonra moleküler düzeyde incelenmiştir. Bu çalışmada, C ve T gruplarına ait proteinler iki boyutlu jel elektroforez ile ayrılmıştır. ABS uygulandıktan sonra azalan veya artan miktarlarda ifade edilen proteinler imaj analizi çalışmaları yapılarak tespit edilmiştir. C ve T gruplarının karşılaştırılması sonucunda nicel olarak en az 2 kat farklılaşmış olan proteinler, matriks destekli lazer desorpsiyon/iyonizasyon, uçuş zamanlı kütle spektrometrisi (MALDI-TOF/TOF-MS) ile analiz edilmiş ve peptid dizileme çalışmaları ile tanımlanmıştır. Tanımlanan proteinler, veri bankaları yardımıyla taranmış ve fonksiyonları ile protein-protein etkileşimleri belirlenmiştir. String ve KEGG veri tabanları aracılığıyla da ABS' nin, kanser hücrelerinde etkilediği biyolojik süreçler ve yolaklar tespit edilmiştir. Elde edilen proteinler, ABS' nin antikanser aktivitesini proteom düzeyinde açıklamak amacıyla kaynaklardaki çalışmalarla ilişkilendirilmiştir. Anahtar Kelimeler: Proteomik, Meme kanseri, İki boyutlu (2D) jel elektroforez, MALDI-TOF/TOF-MS, Ankaferd Hemostat
GW8510 farmakolojik inhibitörünün ın vitro pankreas kanseri modeli üzerine etkilerinin araştırılması
Pankreas kanseri yüksek insidans ve kötü prognoz ile karakterize bir hastalıktır. Pankreas kanseri hastalarının birçoğu, hastalığın ileri evrelerine kadar asemptomik olarak kalabilmektedirler. Güncel koşullarda hastalığın etkin bir tedavisi bulunmamakta ve tedavi edilebilen hastalarda bile hayatta kalma süresinin çok kısa olduğu bilinmektedir. Yaşam süresinin bu denli kısa olduğu bilinen pankreas kanseri hastalığını tedavi etmeye yönelik yeni stratejilerin geliştirilmesinin önemli ve gerekli olduğu görülmektedir. Bu tez kapsamında yapılan ön çalışmada TCGA (The Cancer Genome Atlas- Kanser Genom Atlası) veri bankasında bulunan 176 pankreas kanseri hastasından alınan doku örneklerinden elde edilen tüm genom gen ekspresyon mikroarray verileri ve hastaların klinik bulguları değerlendirilmiştir. Bu değerlendirme sonucunda Ribonükleotid Redüktaz Alt ünite M2 proteinini kodlayan RRM2 geninin pankreas kanseri hastalarında yüksek oranda eksprese olduğunu ve bu yüksek ekspresyonun hastalarda düşük yaşam oranı ve kötü prognoz ile ilişkisinin istatistiksel olarak anlamlı olduğunu tespit edilmiştir (p= 1.62e-4). Kötü prognoz ve yüksek mortalite ile ilişkili bulunan RRM2'ye yönelik literatürde yapılan inhibitör araştırması GW8510'un RRM2 üzerinde inhibitör etkili olduğu fakat bu etkiye yönelik pankreas kanserinde hiçbir araştırma bulunmaması sebebiyle GW8510'un pankreas kanserindeki terapötik etkinliğini araştırmaya yönelik olarak bu tez projesi tasarlanmıştır. Bu amaçla, pankreas kanseri tedavisinde sıklıkla kullanılan Gemsitabin ile GW8510'in sinerjik etkinliği araştırılmıştır. Hücre canlılığı analizi WST-8 metodu ile gerçekleştirilmiş, ardından kullanılan iki kimyasal ajanın sinerjitik etki gösterdiği dozlar CompuSyn kombinasyon analiz programı ile belirlenmiştir. Apoptoz ve hücre döngüsü deneyleri akış sitometri yöntemi kullanılarak, laboratuvar ortamında oluşturulan yara iyileşme modelinin analizi ise Image-J programı ile gerçekleştirilmiştir. GW8510 ajanının RRM2 protein seviyeleri üzerine olan etkisi ise ELISA yöntemi ile belirlenmiştir. Elde ettiğimiz sonuçlar, 10 µM dozda GW8510 uygulanan PANC-1 hücrelerinde % 34 oranında hücre canlılığının inhibe olduğu göstermiştir. Kombinasyon analizi ile 10 µM GW8510 : 10 µM Gemcitabin kombinasyonunun sinerjistik etkileşim gösterdiği belirlenmiştir. Bu kombinasyon dozunun % 89.9 oranında hücrelerin migrasyonunu inhibe ettiği tespit edilmiştir. Bu tez ile GW8510 ajanının PANC-1 pankreatik karsinom hücrelerinde RRM2 protein seviyeleri üzerindeki inhibitör etkisi ilk kez gösterilmiştir. GW8510 'un RRM2 geninin inhibisyonu aracılığıyla pankreas kanseri tedavisindeki kullanım potansiyeli umut vericidir. GW8510'un pankreatik karsinom hücreleri üzerine olan sitotoksik etkinliğinde farklı metabolik yolakların olası rolünün aydınlatılması için ileri çalışmalara ihtiyaç bulunmaktadır.