Polymerase chain reaction
607 theses under this subject heading
Vankomisin, metisilin duyarlı teikoplanin dirençli bakterilerin direnç paternlerinin belirlenmesi
İnsanlarda mikrobiyota elemanlanları olan Stafilokoklar toplum ve hastane kaynaklı infeksiyonların en önemli etkenlerindendir. Metisilin dirençli Stafilokok suşlarında glikopeptid antibiyotikler kullanılır. Metisilin direncinin belirlenmesinde otomatize sistemlerin kullanımının artmasıyla düşük ve yanlış MIK sonuçlarında bile glikopeptid antibiyotiklerin kullanımını arttırmıştır. Bu sonuç vakalarda glikopeptid direncinin geliştirmesini hızlandırmıştır. Artan direnç infeksiyonların tedavisinde zorluklara neden olmuş bu da vakalarda genetik temelin araştırılmasıyla farklı tedavi yöntemlerinin bulunmasının amaçlanmasına yönlendirmiştir. Çalışmamızda laboratuvar örneklerinden izole edilen Staphylococcus suşları incelenmiştir. 30 suşun 3'ü S. aureus, 27'si KNS olarak tespit edilmiştir. Bu suşlar Kirby Bauer disk difüzyon yöntemi ile metisilin, fusidik asit, penisilin, tetrasiklin, trimetoprim-sülfametoksazole, siprofloksasine, klindamisin, eritromisin ve gentamisine direnç olanları belirlenmiştir. Vankomisin ve teikoplanin mikrodilüsyon yöntemi ile duyarlılık durumları belirlenmiştir. Çıkan sonuçlarda teikoplanin dirençli olan suşlara PCR yöntemi ile tcaRAB gen bölgesindeki mutasyonların varlığı araştırılmıştır. PCR ile mutasyon varlığı analiz edilen 15 stafilokok suşunun, 10 tanesi metisilin dirençli, vankomisin duyarlı ve teikoplanin dirençli, 5 tanesi metisilin, vankomisin duyarlı teikoplanin dirençli olarak tespit edilmişti. PCR sonuçlarına göre, teikoplanin dirençli 15 suşta gen bölgeleri amplifiye olmuştur. Sonuçta hastane enfeksiyonlarının etkin tedavisi ve mutasyonlarla oluşan direncin minumuma indirilmesinde teikoplanin dirençlinin genetik temelinin araştırılması alınacak önlemlerin belirlenmesi için önem arz etmektedir. Anahtar kelimeler: Stafilokok, Metisilin, Vankomisin, Teikoplanin, MIK, PCR
Kırklareli bal arısı populasyonlarında (Apis mellifera L.) mtDNA COI ve ND5 gen bölgelerinde PCR-RFLP analizi ile genetik çeşitliliğin belirlenmesi
Bu araştırmada, Kırklareli bal arısı populasyonlarını temsil eden bal arıları mitokondriyel genomda COI ve ND5 gen bölgeleri temelinde incelenmiştir. Apis mellifera populasyonlarının tanımlanmasında restriksiyon parça uzunluk polimorfizmi (RFLP) yönteminden faydalanılmıştır. Bu çalışmada, Türkiye'nin Kırklareli bölgesinde bulunan bal arısı populasyonları COI ve ND5 gen bölgelerinde PCR-RFLP yöntemi ile NcoI, SspI, StyI, AluI, HincII, FokI restriksiyon enzimleri kullanılarak incelenmiştir. Kırklareli ilini temsil eden bal arısı populasyonlarının yanı sıra Tekirdağ yöresinden de olmak üzere toplam 117 adet işçi arı örnekleri materyal olarak kullanılmıştır. Bu çalışmada, COI gen bölgesinin NcoI enzimi ile kesimi sonucunda farklı varyasyon ve mutasyon noktaları tespit edilmiştir. COI/NcoI kesiminde G→A transizyonu sonucu CCATGG şeklinde olan DNA dizisi CCATGA şeklinde yeni bir kesim noktası oluşturmuştur ve bu haplotip C haplotipi olarak adlandırılmıştır. COI/SspI kesimi sonucu daha önce literatürde bildirilen C haplotipi tespit edilmiştir. COI/StyI enzimi ile muamele sonucunda G→A transizyonu sonucu, CCWWGG şeklinde olan DNA dizisi, CCWWGA şekline dönmüş ve literatürde daha önce bildirilen kesim noktası ve B haplotipi tespit edilmiştir. ND5/AluI restriksiyon enzimi ile kesim sonucu tüm örneklerde C haplotipi elde edilmiştir. ND5/FokI ve ND5/HincII enzimleri ile incelenen tüm populasyonlarda kesim tespit edilememiş ve tek bir bant profili sonucu B haplotipi oluştuğu görülmüştür.
Hastanemizde çocuk yoğun bakım ünitesinde menenjit tanısı ile yatan ve lomber ponksiyon yapılan hastaların biyokimyasal ve mikrobiyolojik analizlerinin retrospektif incelenmesi
Menenjit leptomeninkslerin ve subaraknoid alanın enflamasyonu ile giden bir merkezi sinir sistemi enfeksiyon hastalığıdır. Tanı testleri ve tedavi yöntemlerindeki ilerlemelere karşın halen ciddi mortalite ve morbiditeye sahiptir. Bu nedenle erken tanı koymak ve bir an evvel etkene yönelik ampirik tedaviye başlamak oldukça önemlidir. Çalışmamıza hastanemizde menenjit tanısı almış 70 hasta dahil edilmiştir. Hastaların anamnez, fizik muayene, laboratuar sonuçları ve başlanan tedavileri retrospektif olarak incelenmiştir. Hastalarımızın çoğunluğu (%58,6) erkek ve %38,6'sı 1 yaş ve altındadır. İlkbahar ve yaz aylarında toplam başvuran hasta sayısı sonbahar kış aylarındaki başvuranlara göre daha fazladır. Hastalarımızın en sık başvuru şikayeti %84,3 ile ateştir. Meningeal irritasyon bulgusu 2 yaş ve üzerindeki hastalarda %86 oranında pozitifken bu oran 2 yaş altında %22,4 tür. Meningeal irritasyon bulgularının durumuna göre nötrofil, lenfosit ve platelet değerleri açısından istatistiksel olarak anlamlı farklılık tespit edilmiştir (p<0,05). Meningeal irritasyon bulguları pozitif olanların nötrofil değerleri, meningeal irritasyon bulguları olmayanlara göre anlamlı düzeyde daha yüksektir. Meningeal irritasyon bulguları pozitif olanların lenfosit ve platelet değerleri, olmayanlara göre anlamlı düzeyde daha düşüktür. Hastaların kan ve BOS analizleri incelendiğinde medyan değerler hemoglobin için 11,5 g/dL, lökosit için 11220/uL ,platelet için 321500/uL ,CRP için 25,9 mg/dl , ESR için 29 mm/sa , BOS glikozu için 61,2 mg/dL, BOS proteini için 37,4 mg/dl ve hücre sayısı için 100/mm3'tür. Hastalarımızın 4 tanesinde BOS kültüründe etken mikroorganizma saptanmıştır. Kültür negatif hastaların 3 tanesinde ise BOS PCR da etken patojen tespit edilmiştir. Hastalara başlanan en sık tercih edilen ampirik antimikrobiyal tedavi vankomisin ve 3.kuşak sefalosporin kombinasyonudur. Anahtar kelimeler: Menenjit, Ateş, Meningeal İrritasyon Bulguları, Beyin Omurilik Sıvısı
TRNL-F bölgesi analizi yoluyla bazı nar (Punica granatum L.) genotipleri arasındaki genetik polimorfizmin belirlenmesi
Çalışmamızda 24 adet nar genotipinin TrnL-f bölgesi analizi yoluyla genetik akrabalıkları araştırılmıştır. Mardin yöresine ait 18 tane yerel genotipin yer aldığı çalışmada ayrıca Siirt yöresine ait Siirt-Çekirdeksiz adlı genotip ve beş adet tescilli nar çeşidi (Zivzik, Esin, Yılmaz, Hicaz ve Onur) bulunmaktadır. Nar genotipleri ve çeşitlerinin kloroplast genomuna ait TrnL-F bölgesi kullanılarak genetik karakterizasyonları belirlenmiştir. Nar genotiplerinde TrnL-F bölgesine ait primer kullanılarak DNA bölgeleri çoğaltılmış ve PCR sonuçlarına göre DNA dizi analizleri yapılmıştır. Çalışılan nar genotiplerinin akrabalık ilişkilerini belirlemek amacıyla filogenetik ağaçlar çizilmiştir. Maximum Likelihood metodu ve Neighbour-Joining metodu kullanılarak oluşturulan iki dendrogramda birbiriyle uyumlu benzer sonuçlar elde edilmiştir. Her iki dendogramda oluşan alt gruplara 15 nolu örnek dışarıdan bağlanmakta ve diğer genotiplere en uzak akraba olan genotip olduğu görülmektedir. Ancak, Maximum Likelihood analizi genotiplerin birbiri olan yakın akrabalık durumunu daha net biçimde ortaya koyarken, Neighbour-Joining analizi sonucunda elde edilen dendogramda 15 nolu örnek hariç diğerlerinin tek bir grup oluşturduğu görülmektedir.
Streptozotosin ile indüklenmiş diabetik ratlarda oluşturulan yanık modelinde Centella asiatica (kaplan otu) ekstraktının yara iyileşmesi üzerine etkisinin patolojik ve moleküler yöntemlerle araştırılması
Bu çalışmada streptozotosin (STZ) ile indüklenmiş diabetik ratlarda oluşturulan yanık modelinde, Centella asiatica ekstraktı içeren krem ve pomad formülasyonlarının yara iyileşmesi üzerine etkileri patolojik ve moleküler düzeyde araştırıldı. Çalışmada, 12 haftalık toplam 92 dişi Wistar-Albino rat Kontrol (K), yanık (Y), diyabet (D), diyabet+yanık (DY), diyabet+yanık+krem (DYK) ve diyabet+yanık+pomad (DYP) olmak üzere 6 ana gruba ayrıldı. Kontrol grubu 12 rattan oluşurken, deney grupları 16'şar rattan oluştu. Her ana grup da kendi içinde iki alt gruba bölünerek; 7 günlük tedavi (1. grup) ve 14 günlük tedavi (2. grup) grupları oluşturuldu. Diyabet oluşturulacak ratlara, tek seferlik 55 mg/kg dozunda STZ intraperitoneal (ip) olarak enjekte edildi. Enjeksiyondan 2 gün sonra açlık kan glukoz düzeyi ölçüldü ve 200 mg/dl üzeri çıkanlarda diyabet modeli oluşmuş kabul edildi. Yanık gruplarındaki (Y, DY, DYK, DYP) ratların sırt derisi üzerine 1 cm çapında 2. derece termal yanık genel anestezi altında gerçekleştirildi. DYK grubuna, yanık sonrası her gün %2,5'lik Centella asiatica ekstraktı içeren krem, DYP grubuna ise aynı şekilde pomad topikal olarak uygulandı. Gruplara göre lezyonlu deri alanı 0., 3., 7., 10. ve 14. günlerde ölçülüp makroskobik olarak değerlendirildi. Yanık oluşturulmasından sonra 1. gruplardaki ratlara 7. gün, 2. gruplardakilere ise 14. günde nekropsi yapıldı. Uzaklaştırılan kontrol ve lezyonlu deri bölgesinin yarısı moleküler analizler için -80°C'ye, yarısı da histopatolojik incelemeler için %10'luk formole alındı. Makroskobik değerlendirmede, DY grubunda yara alanlarının belirgin şekilde geniş olduğu, tedavi uygulanan DYK ve DYP gruplarında ise 7. ve 14. günlerde anlamlı olarak küçüldüğü gözlendi. Histopatolojik incelemede, tedavi gruplarında PMNL ve MNH infiltrasyonunda azalma, fibroblast/fibrosit yoğunluğu, anjiyogenez ve epitelizasyon parametreleri yönünden ise belirgin artış gözlendi; erken dönemde DY grubuna göre hücresel infiltrasyonun azaldığı, geç dönemde ise fibroblast/fibrosit proliferasyonu ve epitelizasyonun arttığı belirlendi (p<0,05). Moleküler analizlerde, tedavi gruplarında TNF-α düzeylerinde anlamlı azalma, FGF-2, EGF, VEGF ve IGF-1 düzeylerinde ise anlamlı artış gözlendi (p<0,05). Pomad formülasyonunun, istatistiksel olarak önemli olmasa da kreme oranla hafif düzeyde daha yüksek iyileştirici etki gösterdiği dikkati çekti. Sonuç olarak, Centella asiatica ekstraktının diabetik yanık modelinde antiinflamatuvar, rejeneratif, anjiyogenetik ve epitelizan etkileriyle iyileşmeyi desteklediği ve formülasyonun tedavi etkinliği üzerinde kısmen rol oynadığı belirlenmiştir. Elde edilen bulgular ışığında, Centella asiatica içeren bitkisel kökenli topikal ajanların diyabetik yanık tedavisinde umut verici bir alternatif olabileceği ve bu etkinin mekanizmalarının daha ayrıntılı olarak aydınlatılmasının gelecekte yapılacak translasyonel çalışmalara yol gösterici nitelik taşıyabileceği değerlendirilmiştir.
İmmün disregülasyon bulguları olan hastalarda ilişkili yolakların RT-PCR ile değerlendirilmesi
İmmün yolakların kontrolsüz aktivasyonu, yani immün disregülasyon, otoimmünite, lenfoproliferasyon ve maligniteye yol açabilir. Apoptozis, nükleer faktör-κB (NFκB) ve fosfoinositid 3-kinaz (PI3K) yolakları, immün disregülasyonda rol oynayan başlıca yolaklardır. Bu çalışmanın amacı, immün disregülasyon bulguları olan hastaları, seçilmiş inflamatuar genlerin ekspresyon analizleriyle değerlendirmektir. Bu nedenle, literatürde immün disregülasyon ile ilişkili olduğu daha önce bildirilen yolaklardan bazı moleküller seçilerek, gen ifadeleri kontrollerle karşılaştırılmıştır. İmmün disregülasyon bulguları olan hastalar, otoimmün lenfoproliferatif sendrom, immün sitopeni ve EBV ile ilişkili lenfoproliferasyon hastaları olarak gruplandırılarak değerlendirilmiştir. İnflamatuar yolaklardaki seçili genler (CASP8, CASP10, FAS, FASL, AKT, MAP3K7, MAP3K14, mTOR, NFKB1, NFKB2, NFKBIA, TRAF3) için gerçek zamanlı kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) analizi yapılmıştır. Gen ekspresyonundaki kat değişiklikleri logaritmik Delta-Delta Ct (2ˆ(–delta delta CT)) yöntemi kullanılarak değerlendirilmiştir. Tüm hedef genlerin ekspresyonlarının rölatif kantifikasyon değerleri açısından hasta ve kontrol grupları arasında istatistiksel olarak anlamlı fark bulunmuştur. Hedef gen ekspresyonları açısından farklı hasta grupları arasında anlamlı bir fark gözlenmemiştir. ROC eğrisi analizine göre hasta ve kontrolleri ayırt etme açısından en yüksek tanı oranına sahip hedef genler NFKB2, MAP3K7, AKT, mTOR, NFKB1 ve FAS'tır. Bu çalışma ile özellikle immün sitopeni ve lenfoproliferasyonu olan immün disregülasyon hastaları için, NFKB1, NFKB2, MAP3K7, AKT, mTOR ve FAS kullanılarak bir immün disregülasyon skoru/imzası oluşturulabileceği ve bu skorun hasta tanı ve takibinde kullanılabileceği düşünülebilir.
Acil serviste menenjit ve ensefalit ön tanılı hastalarda multipleks gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu yönteminin etkinliğinin araştırılması
ACAN B, Acil Serviste Menenjit ve Ensefalit Ön Tanılı Hastalarda Multipleks Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu Yönteminin Etkinliğinin Araştırılması, Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi Acil Tıp Anabilim Dalı Uzmanlık Tezi, Ankara, 2023. Menenjit ve ensefalit; morbidite ve mortalitesi yüksek, erken dönemde ampirik olarak tedavi başlanması gereken önemli santral sinir sistemi hastalıklarıdır. Etkene yönelik tedaviye geçene kadar olan sürede uygulanan ampirik tedaviye bağlı olarak da komplikasyonlar gelişebilmektedir. Bu çalışmada multipleks gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) yöntemini kullanarak kısa sürede etkeni tayin edebilen Seegene® Allplex Menenjit Paneli ile elde edilen sonuçlar standart yöntemlerle karşılaştırılarak testlerin uyumu ve bunun ampirik tedavi ve hastanede yatış süreleri, komplikasyonlar ve maliyetler üzerine etkilerinin araştırılması amaçlanmıştır. Hacettepe Üniversitesi Erişkin Hastanesi Acil Servisi'ne 1 Temmuz 2021-31 Ocak 2022 tarihleri arasında başvuran ve menenjit/ensefalit ön tanıları ile izlenen 50 hastadan alınan beyin-omurilik sıvısı örnekleri standart yöntemlerle ve menenjit paneli ile değerlendirildi. Standart yöntemlerle menenjit panelinin içerdiği 18 etken dışında pozitiflik saptanan 5 hasta dışlanarak test uyumu 45 hasta üzerinden kappa istatistiği ile değerlendirildi. Menenjit panelinin sensitivitesi %83,3, spesifitesi %97,4, negatif prediktif değeri (NPD) %97,4 olarak hesaplandı. Ayrıca viral PZR sonucu negatif olmasına rağmen ampirik asiklovir tedavisine sekonder akut böbrek hasarı geliştiği düşünülen 10 hastada, menenjit paneli ile etken tayini daha kısa sürede yapılsaydı ampirik tedaviye gerek kalmayıp olası komplikasyonlar önlenerek hastane maliyetlerinin azalabileceği saptandı (p=0,005). Sonuç olarak; Seegene® Allplex Menenjit Paneli saptayabildiği patojenler açısından standart yöntemlerle karşılaştırıldığında, bu yöntemin oldukça kısa sürede standart yöntemlerle uyumlu sonuç vererek ampirik tedavi ve hastane yatış sürelerini kısaltacağı, komplikasyonları ve maliyeti azaltacağı düşünülmektedir. Anahtar kelimeler: Acil servis, menenjit, ensefalit, multipleks PZR
Klinik bacteroides fragilis grubu ı̇zolatlarda enterotoksin ve antibiyotik direnç genlerinin prevalansı ve moleküler tiplendirme
Bacteroides fragilis grubu (BFG) izolatları ile gelişen enfeksiyonların tedavisinde kullanılan antibiyotiklere dünya çapında artan direnç oranları bildirilmektedir. Direnç profilleri ülkeler, bölgeler ve hatta hastaneler arasında değiştiği için sürveyans önem arz etmektedir. Bu çalışmada hastanemizde BFG izolatlarında antibiyotik direnç prevalansının, direncin genetik mekanizmalarının belirlenmesi ve bu izolatların moleküler epidemiyolojisinin saptanması amaçlanmıştır. Antibiyotik duyarlılık testleri agar dilüsyon yöntemiyle, direnç genleri tespiti gerçek zamanlı PZR yöntemiyle, moleküler tiplendirme AP-PCR yöntemiyle yapılmıştır. BFG izolatlarının ampisilin, sefoksitin, piperasilin/tazobaktam, imipenem, meropenem, klindamisin, metronidazol ve tigesikline karşı direnç oranları sırasıyla %97.8, %28.3, %11.6, %7.9, %5.1, %47.8, %0 ve %4.3'tür. Tüm izolatlar içinde cepA, cfxA, cfiA, ermF, ermG, ermB, nim, linA, mefA, msrSA, tetQ, tetX, tetX1 ve bft geni sırasıyla %42.8, %44.9, %8.7, %44.2, %10.9, %2.2, %0.7, %29, %17.4, %7.2, %76.1, %8, %37.7 ve %16.7 oranlarında saptanmıştır. Klindamisin direnç genlerinin (ermF, ermG, ermB, mefA, msrSA, linA) BFG izolatlarında yaygın olduğu belirlenmiştir. Karbapenem direnç geni (cfiA) taşıyan 12 B. fragilis izolatının beşinde upstream bölgesinde IS [IS1187(n=3), ISBf6(n=1), IS612B(n=1)] saptanmıştır. Bu izolatlarda yüksek imipenemaz aktivitesi olduğu gözlenmiştir. Metronidazole azalmış duyarlılık saptanan bir izolatta nimE geni saptanmıştır. AP-PCR ile 101 farklı genotip saptanmış, BFG'de yüksek düzeyde genetik farklılık olduğu gözlenmiştir. Bu çalışmada, BFG izolatlarının antibiyotiklere direnç durumları ve direnç gelişiminde önemli role sahip direnç genlerine ait veri sağlanmıştır.
Sirkadiyen ritmin aşı ile edinilen bağışıklık yanıtına etkisinin CRISPR/CAS9 tekniğiyle araştırılması
Sirkadiyen ritimler, gen ekspresyonunun zaman içinde düzenlenmesiyle ortaya çıkan biyolojik süreçlerdir. Bu süreçler, uyku ve uyanıklık döngüsü, hormonal salım, metabolizma ve bağışıklık fonksiyonları gibi birçok biyolojik süreci etkiler. Bu nedenle sirkadiyen ritimler, genlerin düzenli bir şekilde ifade edilmesi ve vücudun uygun bir şekilde düzenlenmesi için önemlidir. Bir sirkadiyen gen olan TIMELESS, hücre döngüsü, DNA hasar yanıtı gibi çeşitli biyolojik süreçlerde de rol oynadığından, geniş bir araştırma alanı oluşturmaktadır. Bu tez çalışması kapsamında, TIMELESS sirkadiyen geninin bağışıklık sistemiyle ilişkisi araştırılmıştır. Bu amaçla, öncelikle in silico yöntemler kullanılarak TIMELESS'ın fizikokimyasal özellikleri, hücre içi lokalizasyonu ve 3 boyutlu protein yapısı incelenmiştir. Ardından filogenetik ağaç ve motif analizi yapılarak TIMELESS'ın evrimsel ilişkileri belirlenmiştir. Daha sonra in silico yollarla TIMELESS'ı hedefleyen 52 miRNA tespit edilmiştir. Bu miRNA'ların kanserle, bağışıklık ve enfeksiyonla ilişkili olduğu biyoinformatik yollarla belirlenmiştir. Ek olarak, CRISPR/Cas9 yöntemi kullanılarak, HEK293 hücrelerinde TIMELESS geni nakavt edilmiş ve BCG aşısı aracılığıyla innate ve adaptif 84 genin ekspresyon düzeyleri incelenmiştir. Edinilen bulgular sonucunda TIMELESS geninin bağışıklık sistemi fonksiyonlarıyla ilişkili olduğu tespit edilmiştir. Bu tez çalışması TIMELESS geni ve diğer sirkadiyen genlerin fonksiyonlarının daha iyi anlaşılması, sağlık ve hastalık üzerindeki sirkadiyen ritimlerin etkilerinin daha iyi araştırılması ve tedavi yaklaşımlarının geliştirilmesine yardımcı olabilir.
Gıdalardan izole edilen enterobacteriaceae suşlarında genişlemiş spektrumlu beta-laktamazların moleküler yöntemle araştırılması
Günümüzde hastane ve toplumsal kaynaklı olarak dirençli bakterilere artan şekilde rastlanmaktadır. Bu yeni tür biyolojik tehlike tüm Dünya'da insan sağlığını ciddi şekilde tehdit eder seviyelere gelmiştir. Bu nedenle WHO, FAO ve EFSA gibi otoriteler araştırmacıları bu konu üzerinde araştırma yapmaları için teşvik etmektedirler. Genişlemiş spektrumlu beta-laktamazlar (GSBL) plazmid-aracılı bla-genleri tarafından kodlanan, beta-laktam antibiyotikleri enzimatik inaktivasyon direnç mekanizması yoluyla etkisizleştiren ve infeksiyon tedavilerini başarısız kılan enzimlerdir. GSBL-kodlayan bla-genlerin farklı ve/veya türdeş bakteriler arasında aktarılabilir olmaları risk doğurmaktadır. Bakterilerde direnç gelişimi ve yayılmasında hastane ve toplumsal kaynaklı etmenler dışında gıdaların da potansiyel rolleri oldukları düşünülmektedir. Türkiye'de GSBL-kodlayan bla-genlerin varlıklarını tespite dönük hastane ve toplumsal kaynaklı araştırmalar yapılmış olmakla birlikte, gıda kaynaklı bulgular üzerinde ciddi şekilde durulmamıştır. Bu çalışmada hayvansal kaynaklı gıda maddelerinden izole edilen ve kütle spektrometresi ile tiplendirilen toplam 55 adet GSBL-üreten Enterobacteriaceae suşlarında blaTEM, blaSHV ve blaCTX-M genleri ile blaCTX-M altgruplarının karakterizasyonu amaçlanmıştır. GSBL-pozitif izolatlardan elde edilen DNA materyaller Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR) ile amplifiye edilmiş ve amplikonları jel elektroforez tekniği ile görüntülenmiştir. Görüntülenen 1 adet blaTEM pozitif, 1 adet blaSHV pozitif ve 1 adet blaCTX-M pozitif amplikonlar saflaştırılmış, sekanslanmış ve BLAST Programı kullanılarak benzeşme doğrulamaları yapılmıştır. İstatistik analiz için SPSS 19 programı kullanılmıştır. GSBL-kodlayan bla genlerin gıda grupları bazında bulunma sıklıklarının niteliksel kıyaslaması Kruskal-Wallis H-testi ile yapılmıştır. Elde edilen sonuçlar P<0,05 seviyesinde anlamlı kabul edilmiştir. Moleküler incelemeler bla-genlerin dağılımını %96,4 blaTEM, %65,5 blaCTX-M ve %34,5 blaSHV olarak vermiştir. İzolatların %81,8'inin birden fazla bla-geni taşıdıkları tespit edilmiştir. bla-genlerin kombinasyonları %57,8 blaTEM+blaCTX-M, %22,2 blaTEM+blaSHV, %17,8 blaTEM+blaSHV+blaCTX-M ve %2,2 blaTEM+blaCTX-M olarak tayin edilmiştir. CTX-M-pozitif amplikonlar ileri analize alınmış ve alt grupları %97,2 blaCTX-M-1 ve %2,8 blaCTX-M-8 olarak karakterize edilmiştir. Sekanslama ve BLAST analizi sonuçları üç adet GSBL-pozitif amplikonların taşıdıkları blaTEM, blaSHV ve blaCTX-M genleri doğrulamıştır. İstatistik değerlendirme GSBL-kodlayan bla-genler için hayvansal kaynaklı gıdaların türüne bakılmaksızın potansiyel kaynak olduklarını göstermiştir. Sonuç olarak, hayvansal kaynaklı gıdalardan izole edilen Enterobacteriaceae suşlarının GSBL-kodlayan bla-genleri taşıdıkları, çoklu direnç özellikleri gösterdikleri ve tüketicilerin bu genetik materyaller ile kolonize olma riski taşıdıkları tespit edilmiştir.
Alanine scanning on the active site of a novel esterase
Enzymes are widely used in industrial applications and most of them are in the protein structure. Modifications in the protein sequence and protein structure by protein engineering strategies are often used to improve the properties of enzymes. Through all studies such as the finding of new enzymes, characterization and optimization of conditions, efforts are being made to reduce the production cost of the enzyme and to produce it at a higher scale. Esterase enzyme is a hydrolase enzyme used in many fields such as food, industry, health, medicine, detergent industry. It has an α/β hydrolase fold. Due to the high demand of industrial esterase enzymes, attempts are made to characterize novel esterases and increase their properties by using protein engineering approaches. In this thesis, the predicted information about the 3-D structure of a novel esterase enzyme is sought to be elucidated by one of the protein engineering methods which is named as site directed mutagenesis. In previous studies the esterase-encoding gene, isolated from microorganism cultures collected from Acıgöl, was introduced into pET28-a vector and introduced into competent C43 cells for the production of high amount in the laboratory conditions. In this study, pET28-a plasmid containing esterase gene was used as a template DNA. Protein sequence translation of the esterase gene was performed with the ExPASY tool followed by sequence comparison using the SWISS Model software. The closest predicted 3-D structure and protein in the Protein Data Bank database were investigated, and the closest protein was found to be the esterase ybfF protein from Escherichia coli (Ec_ybfF) with 34% similarity. It was noticed that the amino acids (H234 and S206) in the active region of the esterase ybfF protein were similar to the amino acids (H237 and S87) in a particular region of the novel protein obtained in this study. Alanine scanning of these specific regionhas been used to confirm the hypothesis that the amino acids H237 and S87 are members of the catalytic triad of our novel esterase enzyme. The reason for replacing the target amino acids with alanine by PCR reaction with the primers designed by QuikChange® is that alanine does not enforce the electrostatic or H bond effects because of the uncharged methyl groups in its R group and not being heavy. In addition, protein folding and stability do not undergo severe change when compared to the wild-type protein in three-dimensional structure. The mutant amplicons were disrupted by DpnI, the methylation-sensitive restriction enzyme, to remove the unmutated DNA. Subsequently, transformation of DpnI-applied PCR products into C43 cells was performed. Cultures obtained were plated on LB agar plates containing 100 μg/ml kanamycin and incubated overnight at 37 ° C. After isolating the plasmids, agarose gel electrophoresis was performed. The samples were sequenced and then the protein expression steps were followed to check the mutants were constructed. After addition of 0.01 mM IPTG, expression was induced by incubation at 30 ° C for 6 hours. Purification of the proteins of the pET28 vector carrying the H237A and S87A mutant esterase gene was then performed by the 6xHis tag procedure and the control was performed by SDS PAGE analysis. After gene expression induction with IPTG, bands between 25-35 kDa for H237A and S87A were detected. The result was compatible with previous studies while the molecular weight of the esterases in the literature changes between 27-54 kDa. Centrifugal ultrafiltration was performed to purify the obtained protein. Concentration by Bradford protein analysis was measured as 1.3 mg/ml for S87A mutant esterase, 4.5 mg/ml for H237A mutant esterase and 5.5 mg/ml for wild type. Kinetic measurement analysis of wild-type and mutant enzymes was performed at pH 8 with wavelength at 410 nm in the presence of 1 mM Para-nitrophenol (pNP) as substrate. Triplicate enzymatic activity measurements of wild-type and mutant enzymes, each incubated for 20 minutes at 30 ° C, were performed in three independent experiment sets. The kinetic measurements showed that H237A mutant and S87A mutant esterase enzymes lost their activities. These results prove that Serine and Histidine at 87 and 237 positions respectively are members of the catalytic triad of novel esterase enzyme and they are responsible for the catalytic activity of the enzyme.
Şanlıurfa bölgesindeki evcil kanatlılardan mycoplasma gallisepticum izolasyonu ve moleküler karakterizasyonu
Bu çalışma, Şanlıurfa bölgesindeki evcil kanatlılarda yaygın olarak görülen kronik solunum yolu hastalığı (Chronic Respiratory Disease) (CRD)'nın etkeni olan Mycoplasma gallisepticum (M. gallisepticum) (MG)'un yerel suşlarını izole etmek, polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) ile etkeni moleküler olarak doğrulamak, izole edilen suşların amplifiye edilen mgc2 gen bölgelerine, sekanslama ve Restriction fragment length polymorphism (RFLP) ile filogenetik analiz yapmak, referans M. gallisepticum S6 suşu ve M. gallisepticum 6/85 aşı suşu ile, izole edilen saha suşları arasında protein profillerini karşılaştırmak ve hastalıkta oluşan antikorları saptamak amacı ile Western blot (WB) analizlerinin yapılması amacıyla yürütüldü. Çalışmada hayvan materyali olarak 120 evcil kanatlıya ait trakeal svab ve doku örnekleri etken izolasyonu için kullanıldı. İzolasyon çalışması sonucunda, 3 tanesi tavuklara, 4 tanesi ise hindilere ait olan toplam 120 örneğin 7'sinden (%5.8) M. gallisepticum izole edildi. PCR analizi sonucunda, 120 örneğin 65 (%54.2)'i M. gallisepticum yönünden pozitif bulundu. 62 tavuğun 30 (%48.3) 'unda ve 58 hindinin 35 (%60.3)'inde türe özgü DNA tespit edildi. Çalışmada kullanılan 84 trakeal svab örneklerinin 42 (%50)'sinde ve 36 doku homojenatı örneklerinin 23 (%63.9)'ünde türe özgü DNA tespit edildi. Mgc2F ve mgc2R hedef gen bölgelerinin 750-800 bp'de amplifiye edilen PCR ürünlerinin sekanslama sonucunda baz aralıkları (bp) MG4 714 bp, MG79 782 bp, MG9 721 bp, MG68 716 bp, MG95 716 bp, MG120 712 bp, MG66 782 bp, M. gallisepticum 6/85, 718 bp ve M. gallisepticum S6, 787 bp'de elde edildi ve kesim bölgeleri sekans baz aralıkları ile analiz edildi. Elde edilen PCR ürünlerinin AluI, HaeII, HinfI Restriksiyon enzimleri (RE) ile kesimleri sonucu 2 farklı PCR-RFLP tipi elde edildi. MG4, MG9, MG68, MG95, MG120 izolatlarının çoğu aynı PCR-RFLP profili gösterirken, MG66 ve MG79 izolatları ise farklı profil gösterdi. Çalışmada değerlendirilen M. gallisepticum 6/85 aşı suşu ise MG4, MG9, MG68, MG95, MG120 saha izolatlarına yüksek oranda benzer RFLP profilleri gösterdi. M. gallisepticum S6 suşu ise yüksek oranda farklı kesim profili şekillendirdi. İzolatların Mgc2 gen bölgesinin filogenetik analizi sonucu; birbirine yüksek oranda benzer 5 saha izolatı birinci grup (Grup 1: MG4, MG9, MG68, MG95, MG120), 2 saha izolatı ise benzer ikinci grup (Grup 2: MG66, MG79) şeklinde oluşturuldu. Grup 1 ve Grup 2' de yer alan saha izolatları, Güney Afrika ve Brezilya'da ki izolatlara %96-99, Hindistan, Amerika ve Avustralya 'da ki izolatlarla ise %96-100 arasında benzerlik gösterdi. Ayrıca Grup 1 ve Grup 2'de yer alan izolatlar, sırasıyla 6/85 aşı suşuna %99.5 ve %97.3 oranında, TS-11 aşı suşuna %89-90 ve %100, M. gallisepticum S6 suşuna ise %96-96.5 ve %97.2 oranında benzerlik gösterdi. Sadece M. gallisepticum 6/85 ve Grup 1'de yer alan saha izolatlarının mgc2 genine ait nükleotit baz dizisinde 63 nükleotidin delesyona uğradığı tespit edildi. Sodyum Dodesil Sülfat–Poliakrilamid Jel Elektroforez (SDS-PAGE) analizi sonucu Grup 1 ve Grup 2'de yer alan saha izolatlarının hepsinde belirgin olan 120, 100, 70, 64, 67, 56, 53, 45, 43, 26 kDa ağırlığında protein bantları gözlemlendi. MG68 ve MG95 ile Grup 2'de yer alan izolatlar, diğerlerinden farklı olarak 28 kDa'da bant oluşturdu. Grup 2'deki izolatlar da ayrıca 15 kDa ağırlığında bant oluşturdu. M. gallisepticum 6/85 aşı suşu ve standart M. gallisepticum S6 suşu'nda belirtilen tüm protein bantları şekillendi. M. gallisepticum türüne özgü proteinlere karşı oluşan antikorların WB analizi Grup 1 ve Grup 2'de yer alan saha izolatların hepsinde p200, p120, p100, p98, p67, p64, p40, p35, p26'ya karşı antikor şekillendi. Grup 1'de yer alan izolatlar da ayrıca p56 ya karşı antikor oluşturdu. WB analizi için poliklonal serum kullanılması ile, bazı M. gallisepticum izolatları arasında antijenik olarak farklılaşma gözlenebilse de, WB analizinde monoklonal antikorların kullanılmasının, antijenite ve immünojenisite açısından daha spesifik ayrım sağlayabileceği tahmin edilmiştir. Sonuç olarak bu çalışma ile, Şanlıurfa bölgesinde CRD yönünden şüpheli semptom gösteren evcil kanatlılardan patojenik M. gallisepticum etkeninin mevcudiyeti, ve infeksiyonun kanatlı türlerindeki yaygınlığı hakkında ön bilgiler edinildi, hastalık için epidemiyolojik açıdan bir farkındalık oluşturuldu. Kullanılan moleküler yöntemlerin epidemiyolojik yönden saha ve aşı suşlarını ayırt etmede kullanılabileceği, ayrıca bu yöntemlerle izolatlar arasında var olan farklılıkların saptanılabileceği gözlemlendi. Mevcut verilere dayalı olarak saha suşlarının daha fazla tanınması ve tanımlanması için farklı M. gallisepticum genleri üzerinde daha fazla çalışma yapılması gerekmektedir. Ayrıca bölgede bulunan sonuçların, M. gallisepticum infeksiyonu teşhis olasılığını artıracağı, yani aşı suşuna bağlı nihai hastalığı netleştirmede, aşılanmış sürüleri doğal olarak infekte olmuş sürülerden ayırt etmede ve mikoplazma infeksiyonlarının izlenmesi yönünde etkili olacağı düşülmektedir.
Sodyum florürün (NAF) böbrek hücre serilerindeki sitotoksik etkisinin araştırılması
Bu çalışma, farklı dozlarda ve zamanlarda alınan hücre örneklerinde, NaF uygulanması ile belirli düzeylerde sitotoksisite oluştuğu belirlenen NRK-52 böbrek hücre serisinde, sitotoksisitenin meydana gelmesinde, apoptotik, otofajik ve nekrotik mekanizmaların olası rollerinin araştırılması amacıyla planlandı. Hücreler, in vitro koşullarda düzenli geçişlerde çoğaltıldı. NaF'nin IC50 değeri MTT ile belirlendi. Hücre numuneleri, hücrelerin IC50 değerlerine göre hazırlanan örneklerden 3, 12 ve 24 saat sonra alındı. Biyokimyasal analizler için, hücreler tripsinizasyon ile toplandı ve donma / çözme metodu ile lize edildi. MRNA manuel yöntemle izole edildi. Apoptotik, otofajik ve nekrotik genler için cDNA elde edildi ve hedef gen DNA, gerçek zamanlı PCR yöntemi ile amplifiye edildi. Bu seçilmiş genlerin ekspresyonu değerlendirilmiş ve NaF kaynaklı moleküler yollarda zamana bağlı olarak önemli değişiklikler tespit edilmiştir. Üçüncü saatte hücrelerin apoptotoik yolağı kullanarak apoptoza girdikleri, 12. saatteki ölümlerin tamamen otofajik yolak kaynaklı olduğu ve 24. saatte ise, otofajide duramayan hücrelerde nekrotik sinyal ve apoptozis yolaklarındaki genler vasıtasıyla, hücre ölümünün tamamlandığı tespit edildi. Sonuç olarak, NRK-52 böbrek hücre serisinde NaF bağımlı hücre ölümlerinde, moleküler mekanizmaların zamana bağlı olarak aktivite gösterdiği belirlendi. NaF eklendikten sonraki 3. Saatten itibaren sitotoksik etki mekanizmalrının harekete geçtiği ve 12 ve 24. Saatlerde farklı mekanizmaların hücre ölümlerini hızlandırdığı kanısına varıldı. Anahtar kelimeler: NaF, böbrek, sitotoksisite, hücre kültürü
Türkiye'nin Doğu Anadolu popülasyonunda özofagus kanseri ve P21 polimorfizmleri arasındaki ilişki
Özofagus kanseri dünya genelinde en yaygın sekizinci kanser türüdür. Türkiye'nin Doğu Anadolu Bölgesinde özofagus kanserine yakalanma oranı oldukça yüksektir. Hücre büyüme döngüsünü düzenleyen p21, normal büyüme ve farklılaşma için çok önemlidir. Birçok epidemiyolojik çalışma, p21'deki polimorfizmlerin özofagus ve diğer kanserler ile ilişkisini incelemiştir. Bu çalışmanın amacı, Türkiye'nin Doğu Anadolu bölgesinde özofagus kanserli hastalarda p21 polimorfizmlerinin (rs1059234 C/T, rs1801270 C/A ve rs3176352 G/C ) görülme sıklığını ve muhtemel ilişkisini araştırmaktır. Bu polimorfizmler protein ekspresyonunu etkileyebilir ve kanser duyarlılığında rol oynayabilir. Literatürde diğer popülasyonlarda bazı çalışmalara rastlanmış, ama Türkiye'de bu polimorfizmler ile özofagus kanseri arasındaki ilişkiyi gösteren bir çalışmaya rastlanmamıştır. Bu çalışma, 2017-2018 yılları arasında 69 hasta ve 101 sağlıklı kontrol grubundan toplanan örnekler üzerinde gerçekleştirilmiştir. Gerçek zamanlı PCR'da Taqman Assay yöntemi ile genotipleme yapılmış ve istatistiksel analizler yapılarak sonuçlar belirlenmiştir. p21 polimorfizmlerinin allel ve genotip frekanslarında hasta ve kontroller arasında istatistiksel olarak anlamlı bir farklılık gözlenmemiştir. Ayrıca bu polimorfizmler ve diğer klinik özellikler arasında da bir ilişki görülmemiştir. Bununla birlikte özofagus kanser riskinin ailede kanser, sigara kullanımı, Van otlu peyniri, tandır dumanı ve reflü gibi diğer faktörler ile ilişkili olduğunu gözlemledik (p<0,05). Bulgularımız Türkiye'nin Doğu Anadolu popülasyonunda diğer demografik faktörlerin özofagus kanser riskini arttırabileceğini, fakat p21 polimorfizmleri (rs1059234 C/T, rs1801270 C/A ve rs3176352 G/C) ve özofagus kanseri riski arasında bir ilişki olmadığını göstermiştir (p>0,05). Bu sonucun doğrulanması için diğer genetik faktörlerin ve daha fazla vakanın incelenmesine ihtiyaç vardır. Anahtar Kelimeler: Genotipleme, gerçek zamanlı PZR, Özafagus kanseri, p21, polimorfizm,
Van Belediye mezbahasında kesilen ruminantlarda paramphistomum SPP.'nin moleküler identifikasyonu
Paramphistomum türlerinin morfolojik olarak teşhisi mikroskobik yöntemlerle yetersiz olduğundan, kesin teşhis için moleküler yöntemlere ihtiyaç duyulmaktadır. Bu çalışma Mart 2018–Eylül 2018 tarihleri arasında Van Belediye mezbahasına kesime getirilen ruminantlarda bulunan Paramphistomum spp.'nin moleküler yöntemler ile identifikasyonu amaçlandı. Çalışma materyali, toplam 100 adet enfekte ruminantdan (50 sığır ve 50 koyun) toplanan ergin Paramphistomum spp.'lerden oluşmaktadır. Paramphistomum parazitlerinin DNA izolasyonları, ticari kit ile yapıldıktan sonra rDNA ITS2 gen bölgesi PCR ile çoğaltıldı. Elde edilen PCR ürünleri agaroz jelde yürütülerek 399 bp'lik bantlar elde edildi. Amplikonlar sekanslanmış ve BLAST ile Genbank'daki referans sekanslarla karşılaştırıldı. İzolatların genotipleri tam veya en yakın benzerliklerine göre belirlendi. Ayrıca, Neighbour-Joining Tree kullanılarak MEGA 7 program ile filogenetik ağaç oluşturuldu. Çalışmamızda elde edilen 10 adet PCR ürünününden çift yönlü sekans analizi yapıldı. Sekans analizi sonucu 5 koyun ve 3 sığırdan Paramphistomum leydeni, 2 adet sığırdan ise Calicophoron daubneyi identifiye edildi. Sonuç olarak, Türkiye'de daha önce morfolojik tanı yöntemleri ile varlığı bildirilen Calicophoron daubneyi'nin Van ilinde moleküler yöntemler ile varlığı kesinlik kazanmış olup, ayrıca daha önce Türkiye'de bildirilmeyen P. leydeni ise ilk defa moleküler yöntemlerle bu çalışma ile tespit edildi.
Yoğun bakımdan izole edilen MRSA suşlarında Meca geni varlığının konvansiyonel, otomatize ve PCR yöntemi ile tespiti
Metisiline dirençli S. aureus MRSA suslarının hastane ve toplum kökenli infeksiyon etkeni olarak günümüzdeki önemi artmaktadır. Bu çalışmanın amacı, S. aureus suşlarında metisilin direncinin belirlenmesi için kullanılan farklı yöntemler ile genotipik bir yöntem olan mecA geni varlığının kıyaslanması amaçlanmıştır. Çalışmaya 2010-2016 yılları arasında Yüzüncü Yıl Üniversitesi Tıp Fakültesi Mikrobiyoloji laboratuvarına gelen çeşitli örneklerden (yara, kan, balgam, solunum, balgam, apse, osteomiyelit vs.) izole edilmiş 50 adet MRSA suşları belirlenerek çalışmaya dâhil edilmiştir. Her hastadan tek bir izolat alınmıştır. Çalısmamızda, MRSA suşlarinda mecA geni varliğinin konvansiyonel, otomatize ve PCR yöntemi ile araştırılmıştır. İncelenen MRSA suşlarında mecA geni varlığının tespitinde Oksasilin E-test yöntemi ile incelenen 50 adet MRSA suşlarının 49'unda mecA geni varlığına rastlanırken (MİK>2), 1 örnekte (MİK ≤ 2) mecA geni varlığına rastlanmamıştır. Sefoksitin E–test yöntemi ile incelenen örneklerin tamamında mecA geni varlığı tespit edilmiştir (MIC>4). Vitek 2 Otomatize yöntemi ile incelenen örneklerin tamamında mecA geni varlığı tespit edilmiştir. PCR yöntemi ile incelenen örneklerin tamamı pozitif, yani mecA geni varlığı tespit edilmiştir. Oksasilin E-test yöntemi ile incelenen suşların duyarlılık oranı %98 iken, Sefoksitin, Vitek 2 Otomotize ve PCR yöntemleri ile incelenen suşların duyarlılık oranı %100 olarak tespit edilmiştir. MRSA oranın yüksek olduğu hastanelerde gereken önlemlerin alınması açısından mecA araştırılması doğru sonuca ulaşmada büyük bir önem arz etmektedir. Çalışmada üç yöntemin sonuçları hemen hemen birbirlerine yakın olduğu için, doğru tespit yapmak için üç yöntem de kullanılabilir.
Pnömonili sığır akciğer örneklerinde mycoplasma bovis'in real time PCR ile araştırılması
Bu çalışmada, pnömonili sığır akciğerlerinde Mycoplasma (M.) bovis'in gen spesifik primerlerin kullanıldığı Real-Time PCR yöntemi ile araştırılması amaçlandı. Makroskobik olarak pnömoni tanısı koyulan 100 adet sığır akciğer örneğinin 52'sinde Real-Time PCR ile M. bovis identifiye edilirken, 58'inde konvansiyonel bakteriyolojik yöntemler ile çeşitli bakteriyel etkenlerin varlığı tespit edildi. Çalışmada M. bovis'den sonra en yüksek oranda (%25) Escherichia coli tespit edilirken, Pasteurella multocida, Klebsiella pneumoniae, Sphingomonas paucimobilis, Mannheimia haemolytica, Staphylococcus epidermidis ve Staphylococcus spp. örneklerin sırasıyla %13, %7, %7, %4, %1 ve %1'inden izole edildi. Akciğer örneklerinin 42'sinden ise konvansiyonel bakteriyolojik yöntemler ile bakteriyel etken izole edilmedi. Çalışmadan elde edilen bulgular ile M. bovis'in sığırlarda solunum sistemi hastalıklarına neden olan önemli bir etken olduğu belirlenmekle birlikte hastalığın teşhis ve tedavisinde diğer bakteriyel etkenlerin varlığının da göz önünde bulundurulması gerektiği kanatine varıldı. Anahtar Sözcükler: Sığır, Akciğer, Mycoplasma bovis, Real Time-PCR
Genç yaş iskemik inme hastalarında telomer uzunluğunun incelenmesi
Telomer uzunluğu sıklıkla biyolojik bir yaşlanma belirteci olarak kabul edilmektedir. Telomer uzunluğunun kardiyovasküler sistemde biyolojik bir yaşlanma belirteci olduğu yapılan birçok çalışma ile desteklenmiştir ve kısa telomer boyu ateroskleroz ile ilişkilendirilmiştir. İnmenin biyolojik yaşlanma belirteci olarak kabul edilen telomer uzunluğuyla ilişkisini inceleyen birkaç çalışma mevcuttur ve bu ilişki bugüne kadar net olarak gösterilememiştir. Çalışmamızda genç yaş iskemik inme hastalarında telomer uzunluğu çalışıldı. Çalışmaya son 3 yılda genç yaş iskemik inme öyküsü olan 60 hasta ve yaş, cinsiyet, inme için risk faktörü olarak tanımlanan benzer hastalık öyküsü olan 40 sağlıklı gönüllüden oluşan kontrol grubu dahil edildi. Her iki grupta PCR yöntemiyle telomer uzunluğu çalışıldı. Çalışmamızda hasta grubunun ortalama telomer uzunluğu (7,52 ± 3,29 kilobaz) anlamlı olarak kontrol grubundaki kişilerin ortalama telomer uzunluğundan literatürden farklı olarak yüksek bulunmuştur. Bununla beraber hasta ve kontrol grubundaki kişilerin telomer uzunluğu sosyo-demografik özellikler ve iskemik inmenin risk faktörleri (sistolik KB, diastolik KB, DM, BMI, homosistein, LDL, nabız, HGB, HCT,sigara ve alkol kullanımı,) arasında anlamlı bir farklılık gösteremedik. Bu sonuç örneklem sayısının diğer çalışmalara göre az olması ve çalışma dizaynıyla açıklanabilir. Çalışmamız uzun telomer ile genç yaş iskemik inme arasında böyle bir ilişkiyi gösteren ilk çalışma olması açısından çok önemlidir. Bu sonuç kısmen çalışmanın dizaynı, etnisite, örneklem büyüklüğü, çalışma popülasyonunun yaşı ve telomer uzunluğunun çalışıldığı yöntemler ve doku ile ilgili farklılıklarla açıklanabilir. Sonuç olarak; telomer uzunluğu ve inme arasındaki ilişkinin daha iyi anlaşılabilmesi için gelecekte daha genç yaştaki hastaların olduğu daha geniş sayıdaki örneklemlerde daha çok çalışmaya ihtiyaç olduğu görülmektedir.
Sağlıklı insan uyarılmış pluripotent kök hücrelerinden kortikal nöron elde edilmesi
Uyarılmış pluripotent kök hücreler kişiye özel tedavi olanağı sağlaması, hastalık modelleme ve ilaç denemeleri açısından benzersiz bir kaynaktır. Hastandan alınan kan veya fibroblast hücrelerinden çeşitli transkripsiyon faktörleriyle veya küçük moleküllerle hedef doku ve organ oluşumu sağlanabilir. Böbrek, kalp, karaciğer, beyin vb. doku ve organlara farklılaştırma imkânı bulunmaktadır. Bunların arasında en ilgi çekici olanı şüphesiz beyindir. Diğer doku ve/veya organların aksine biyopsi imkanının olmaması nedeniyle çalışılması zor bir bölgedir. Hastadan alınan kan ve/veya fibroblast örneğine Yamanaka faktörlerinin transferi ile pluripotentlik özellik kazandırılmasının ardından uygun farklılaşma protokolleri ile sinir hücrelerine veya organoide farklılaşma sağlanabilir. Bu tez çalışmasının amacı sağlıklı insan uyarılmış pluripotent kök hücrelerinden (uPKH) altı adet küçük molekül kullanarak 12-15 gün içerisinde kortikal nöron eldesini sağlamaktır. Bu kapsamda karakterizasyonu tamamlanmış olan sağlıklı insan uPKH'leri kültürde çoğaltılmıştır. Pluipotentsi belirteçlerini koruduğu kontrol etmek amacıyla qPCR ve immun floresan boyamalar ile teyit edilmiştir. Nöronal yönde farklılaşma deneyleri için hücrelere altı küçük molekülden oluşan kokteyller her gün farklı dozlarda uygulanmıştır. Hücrelerin morfolojik durumu her gün ışık mikroskobu altında izlenmiştir. Protokolün sonunda hücrelerden RNA toplanmış ve immun floresan boyamalar yapılmıştır. Yapılan qPCR deneylerinin sonucunda pozitif kontrole göre elde edilen hücrelerde kortikal nöron belirteçlerinden DCX , FOXG1 ve REELİN ifadelerinde anlamlı bir artış gözlenmiştir. İmmun floresans boyamalarda nöron belirteçleri olan MAP2 ve TUJ1 pozitif hücreler gözlemlenmiştir.
Mycobacterium abscessus alt tür abscessus izolatlarının ilaç duyarlılık paterninin belirlenmesi
En önemli hızlı üreyen nontüberküloz mikobakterilerden biri olan Mycobacterium abscessus kompleks, akciğer ve akciğer dışı enfeksiyonlara yol açan, birçok antimikrobiyal ajana dirençli olduğundan tedavisi zor bir mikroorganizmadır. Özellikle kistik fibroz gibi altta yatan hastalığı olan kişilerde, immün yetmezliği olan kanser, transplanstasyon hastalarında neden oldukları enfeksiyonların tedavisi zor ve uzun sürmektedir. Son yıllarda da dünya genelinde birçok ülkede neden oldukları enfeksiyonlarda artış bildirilmiştir. Mycobacterium abscessus kompleks, Mycobacterium abscessus alt tür abscessus, Mycobacterium abscessus alt tür massiliense ve Mycobacterium abscessus alt tür bolletii olmak üzere üç alt türden oluşmaktadır ve bu alt türlerin ilaç duyarlılık paternleri farklılık göstermektedir. Bu çalışmanın amacı, Mycobacterium abscessus alt tür abscessus izolatlarının antibiyotik duyarlılık paternlerinin referans yöntem sıvı mikrodilüsyon ile belirlenmesi ve klaritromisin direncinin hem fenotipik olarak hem de gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu ile moleküler olarak gösterilmesidir. Çalışma sonucunda 55 Mycobacterium abscessus alt tür abscessus izolatının %87.3'ü klaritromisin, %81.9'u siprofloksasin, %40'ı imipenem, %30.9'u tobramisin, %29.1'i moksifloksasin, %7.2'si sefoksitin ve %5.4'ü amikasin dirençli saptanmıştır. Antibiyotik duyarlılık testi yapılan 55 izolatın 7'si klaritromisine duyarlı iken 15 ve 33 izolatta sırasıyla kazanılmış ve indüklenebilir klaritromisin direnci saptanmıştır. Moleküler olarak bu izolatların klaritromisin direncinin araştırıldığı erm(41) ve rrl gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonlarında duyarlılık profilleri ile uyumlu erime eğrileri gösterilmiştir.
İstanbul ili ve çevresinde toplanan kenelerde nairo, flebo ve flavivirusların araştırılması
Bu çalışmada, İstanbul ili ve çevresinden toplanan örneklerde kene kaynaklı virüslerin taranması, kene kaynaklı hastalıkların epidemiyolojisinin belirlenmesi ve kene türlerinin tespit edilmesi amaçlanmıştır. Arbovirüsler içerisinde Bunyavirales takımında Nairoviridae, Peribunyaviridae ailelerinde ve Flaviridae ailesinde yer alan Nairovirüs, Flebovirüs ve Flavivirüs cinsleri, kenelerle bulaşma gösteren, aralarında Kırım-Kongo Kanamalı Ateşi (KKKAV), trombositopeni sendromlu yüksek ateş ve kene kaynaklı ensefalit virüsü gibi, tüm dünyada önemli sağlık sorunları oluşturmuş virüsleri içermektedir. Belirli bir bölgede vektör kaynaklı ya da patojen olmayan virüs aktivitesinin bilinmesi, hastalık riskinin değerlendirilebilmesi ve epidemiyolojik özelliklerin incelenebilmesi için, eklembacaklıların sürveyansı önem taşımaktadır. Bu çalışmada, ülkemizde nüfus yoğunluğu en fazla İstanbul ili ve çevresinden toplanan kene örneklerinde jenerik PZR yöntemleri ile nairo-, flebo- ve flavivirüsler araştırılmış, saptanan virüsler DNA dizi analizi ile tanımlanmış ve bulgular tartışılmıştır. Çalışma kapsamında 2013, 2014, 2015 ve 2018 yıllarında İstanbul, Kırklareli, Edirne ve Tekirdağ illerinden 37 lokasyondan bayraklama ve hayvan örneklemesi ile 7154 kene toplanmıştır. Morfolojik incelemeler, örnekler arasında en sık saptanan türün Ixodes sp. (%30,92) olduğunu göstermiş, bunu Hyalomma marginatum (%14,29), Hyalomma scupense (%13,45), Haemaphysalis parva (%9,40), Rhipicephalus turanicus (%8,17) ve diğerleri takip etmiştir. Toplanan örnekler; lokasyon, cinsiyet ve türe göre toplam 572 havuz olarak virüs taramasına alınmış, %0,7'sinde (4/572) nairovirüs ve %3,3'ünde (19/572) flebovirüs pozitifliği saptanmıştır. Ancak havuzlarda flavivirüs RNA'sı tespit edilememiştir. Bölgede KKKAV ve KKKAV-AP92 izolatı saptanmıştır. Bunun yanı sıra ülkemizden daha önce bildirilmiş olan yeni kene kaynaklı flebovirüslere dair veriler elde edilmiştir. Bu veriler kene kaynaklı flebovirüsler ile ilgili bölgeden yapılmış olan ilk bildirimdir. Anahtar kelimeler: Kene, Nairovirüs, Flebovirüs, Flavivirüs, PCR
Yaygın değişken immün yetmezlik hastalarının klinik, immünolojik ve genetik özelliklerinin B hücre alt grup özellikleri ve KREC sayıları ile korelasyonunun araştırılması
Yaygın Değişken İmmün Yetmezlik (YDİY/CVID), B hücre farklılaşması ve antikor yapımında bozukluk ile seyreden, aşılara zayıf yanıt oluşması ve tekrarlayan enfeksiyonlar ile karakterize olan primer antikor eksikliklerinin heterojen bir grubudur. Son yıllarda, B hücre popülasyonlarının fenotiplendirmesine dayanarak hastalığın sınıflandırılmasına yönelik girişimlerde bulunulmuştur. Kappa-silici rekombinasyon eksizyon halkalarının (KREC) miktar tayinine dayanan gerçek zamanlı kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) testi B hücre hastalıklarında kullanılmaktadır. KREC'ler, kemik iliğinde, B hücre reseptörü (BHR) genlerinin V(D)J yeniden düzenlenmesi sırasında ortaya çıkan epizomal DNA parçalarıdır. Bu çalışmada Hacettepe Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları Anabilim Dalı İmmünoloji Bölümü'nde YDİY tanısı alan 30 hastanın akım sitometri testi ile B hücre alt grupları, RT-qPCR testi ile de KREC sayıları 41 sağlıklı kontrol ile karşılaştırılarak değerlendirilmesi hedeflenmiştir. Hasta grubunun yaş ortalaması 28.5±15.6 yıl idi. Cinsiyetler arası dağılım oranı 1/1 idi. Ebeveyn akrabalığı oranı %33 olarak bulundu. En sık başvuru şikayeti sık enfeksiyon idi. IgM seviyeleri normal düzeyde olan 6 hasta (%20), IgA seviyeleri normal düzeyde olan 2 hasta (%6,67) vardı. Yirmi hastanın (%66,67) CD19+ hücre sayısı yaşa göre düşükken, 14 hastanın (%46,67) CD4+ hücre sayısı düşüktü. Sağıklı kontrol grubunda yaş arttıkça B hücre sayılarının azaldığı görüldü, B hücre alt gruplarından transisyonel B hücre, naif B hücre ile yaş arasında negatif korelasyon bulundu. Kontrol grubunda KREC sayıları cinsiyetten etkilenmiyordu ve artan yaş ile birlikte azalmaktaydı (p<0,01). Kontrol ve hasta gruplarına ait toplam B hücre sayıları ile KREC sayıları arasında pozitif korelasyon saptanmıştır (p<0,01). Çalışmada ayrıca sağlıklı popülasyona ait yaşa göre B hücre alt grup sayıları ve KREC sayıları elde edilmiştir. Kontrol grubunda B hücreleri ve KREC düzeyinin yaşla olan negatif korelasyonun değerlendirilmesi, immün yaşlanmanın gösterilmesi açısından da önemli olabilir. Anahtar kelimeler: YDİY, B hücre, KREC, RT-qPCR, akım sitometri
Mycobacterium tuberculosis izolasyonu öncesinde uygulanan iki farklı dekontaminasyon, homojenizasyon işleminin karşılaştırılması
Özden, M., Mycobacterium tuberculosis İzolasyonu Öncesinde Uygulanan İki Farklı Dekontaminasyon İşleminin Karşılaştırılması, Hacettepe Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Tıbbi Mikrobiyoloji Programı Yüksek Lisans Tezi, Ankara, 2019. Bu çalışmanın amacı, iki farklı dekontaminasyon yöntemi olan, N-asetil-L-sistein-sodyum hidroksit (NALC-NaOH) ve Decomics homojenizasyon-dekontaminasyon kitinin etkinliğini, Mycobacterium tuberculosis H37Ra suşu eklenerek hazırlanan balgam örneklerinde boyama, kültür ve polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) ile değerlendirmektir. M. tuberculosis H37Ra suşu kullanılarak içerisinde 108-101/ml yoğunluğunda bakteri süspansiyonları hazırlanmıştır. Bu süspansiyonlardan üç ml balgam bulunan 50 ml'lik steril tüpün içerisine 0,5 ml eklenmiştir. Otuzyedi defa İki set şeklinde hazırlanan örnekler NALC-NaOH yöntemi ve Decomics kiti kullanılarak homojenize-dekontamine edilmiştir. Dekontaminasyon sonrası sıvılardan aside dirençli boyama (ARB) yapılarak mikroskopta incelenmiş, Löwenstein – Jensen (LJ) ve Middlebrook (MB) 7H10 besiyerlerine ekilmiş ve PZR yapılmıştır. ARB ve PZR incelemelerinde 10⁸, 10⁷, 10⁶, 10³, 10² ve 10¹/ml yoğunluklarda NALC-NaOH yöntemi ve Decomics kitinin sonuçları arasında anlamlı bir fark yokken; 105, 10⁴/ml oranında bakteri bulunan örneklerin ARB boyama ve PZR'larında NALC-NaOH yöntemi, Decomics kitine göre daha başarılı bulunmuştur. İstatistiksel olarak anlamlı bir fark vardır, [ARB boyama (10⁵/ml) p=0,016 ve PZR (10⁵/ml) p=0,5; ARB boyama (10⁴/ml) p=0,012 ve PZR (10⁴/ml) p=0,016]. MB ve LJ besiyerlerinde yapılan kültür sonunda, 10⁸, 10⁷, 10⁶, 10⁵, 10³, 10² ve 10¹/ml'de iki yöntem arasında fark bulunmamıştır. Ancak 10⁴/ml oranında bakteri bulunan örneğin ekimlerinde iki yöntem arasında farkın istatistiksel olarak anlamlı olduğu saptanmıştır. Sonuç olarak Decomics kiti balgamı etkin olarak dekontamine edebilmekte ve 105-108/ml yoğunlukta bakteri içeren örneklerde izolasyon başarılı olmaktadır. Decomics kitinin özellikle balgamında yoğun bir şekilde tüberküloz basili bulunan hastalarda, çok fazla ekipman ve santrifüj gerektirmediği için, kısıtlı olanakları olan laboratuvarlarda kullanılabileceğini söyleyebilmekteyiz. Anahtar Kelimeler: Mycobacterium tuberculosis kompleks, homojenizasyon dekontaminasyon, izolasyon
Nanopore sekanslama teknolojisi kullanılarak, kişi tanımlama kiti geliştirilmesi
Amaç: İnsan Deoksiribo Nükleik Asidi (DNA) bilinen en stabil biyolojik materyallerden bir tanesi olup, kişiye özel bir çok tanımlama bölgesi içermektedir. Son yıllarda, DNA üzerindeki belirli Tek Nükleotid Polimorfizm'lerinin (Single Nucleotide Polymorphism-SNP) genotiplendirilmesi, özellikle kimliklendirme çalışmalarında giderek yaygınlaşan ve yüksek ayrım gücü sunan bir yöntemdir. Genotiplendirme işlemi, yeni nesil dizi analizi teknolojisindeki hızlı ilerlemeler sayesinde giderek pratikleşmiş olsa da bu cihazların birçoğunun uzun sürede sonuç vermesi ve büyük veri analizleri gerektirmesi, özellikle hızlı kimliklendirme gereken durumlarda büyük bir dezavantaj oluşturmaktadır. Bununla birlikte, 4. nesil olarak geçen Oxford Nanopore teknolojisini kullanan bir cihazın (Minion) uzun okumalar yapması, hızlı analiz ve küçük boyutları sayesinde sahada kullanıma imkan sağlaması, bu dezavantajları ortadan kaldırmıştır. Bu projede; Oxford Nanopore sekanslama platformuna uyum sağlayacak, teknolojik ve pratik SNP temelli bir kişi tanımlama prototipi geliştirilmesi amaçlanmıştır. Gereç ve yöntem: Ticari DNA kullanılarak, literatürde kişi tanımlama için sıklıkla kullanılan 52 SNP bölgesi multipleks Polimeraz Zincir Reaksiyonu (Polymerase Chain Reaction-PCR) metodu ile amplifiye edilmiştir. Bu amplikonlar Oxford Nanopore Minion cihazı ile sekanlanmıştır. Sekans verilerine göre özgün bir biyoinformatik iş akışı tasarlanmıştır. Bulgular: Üç ticari DNA örneği üzerinden yapılan çalışmalarda Nanopore verilerinin 52 SNP bölgesinde de tam olarak doğru sonuç verdiği gözlenmiştir. Toplam süre 1 saatin altında tamamlanmıştır. Sonuç: Bu tez sonucunda 52 adet SNP bölgesi Oxford Nanopore Minion cihazıyla başarılı bir şekilde sekanslanmıştır. Aynı zamanda SNP temelli kişi tanımlama için dünya üzerinde erişilmiş en hızlı süre elde edilmiştir.