İlaç yeniden konumlandırmanın in silico ve in vitro uygulaması

Meme kanseri dünya çapında kadınlar arasında en sık rastlanan kanser türüdür. Yapılan son kanser istatistiklerine göre; meme kanseri 2017 yılında kadınlarda tanısı koyulan kanserlerin %30'unu oluşturarak, en yüksek görülme sıklığına sahiptir. Bu hastalık, nüfus üzerindeki büyük etkisi nedeniyle, kritik bir sağlık sorununu temsil etmekte ve erken tanı ve tedavisi için moleküler seviyede daha fazla araştırma yapılmasını gerektirmektedir. Meme kanseri hastalarının sağ kalım oranını etkileyen en önemli faktörlerden biri metastazdır. Yakın zamanda yayınlanan bir makale ile normal şartlarda sadece beyinde ifade edildiği düşünülen GABAA reseptör alfa3 (Gabra3)'ün meme kanseri hücrelerinin metastazında kritik bir rol aldığı kanıtlanmıştır. Ayrıca Gabra3'ün normal meme epitelyal hücrelerinde ifade edilmediği yapılan birçok çalışma sayesinde bilinmektedir. Bu tez çalışmasında; MCF-7 ve MDA-MB-436 kanser hücre hatlarındaki Gabra3 ifadesinin incelenmesi ve bir GABA antagonisti olan flumazenil molekülünün MDA-MB-436 meme kanseri hücrelerine karşı etkisinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Bu amaç doğrultusunda, Gabra3/Gabrg2 dimeri modellenmiş ve bilgimiz dahilinde, literatürde ilk kez flumazenil ve Gabra3/Gabrg2 dimerinin moleküler kenetlenme çalışması yapılmıştır. Gabra3/Gabrg2 dimerinin moleküler kenetlenme analizlerinde uygulanan bütün programlar için altyapı olarak Maestro Molecular Modeling Interface 11.3 (Schrödinger Release 2017-3: Maestro, Schrödinger, LLC, New York, NY, 2017) kullanılmıştır. Yapılan SP (Standart precision) ve XP (Extra precision) Glide moleküler kenetlenme çalışmaları sonucunda flumazenilin Gabra3/Gabrg2 dimerine XP metotunda -6.229, SP metotu ile ise -7.167 skoru ile bağlandığı belirlenmiştir. Ardından bu bağlanmanın in vitro etkisini gözlemlemek için MCF-7 ve MDA-MB-436 hücrelerinin kültürü yapılmıştır. MDA-MB-436 hücrelerine 0,01 µM, 1 µM, 10 µM ve 100 µM kosantrasyonlarındaki flumazenil, 24 saat boyunca uygulanmış ve bir grup hücreye DMSO (dimetil sülfoksit) uygulanmıştır. Tüm örneklerden sırasıyla yapılan total RNA izolasyonu ve cDNA sentezinin ardından elde eldilen genomik materyal ile kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) gerçekleştirilmiş ve hücrelere ait Gabra3 ifadesi ve değişimleri karşılaştırılmıştır. In vitro deneylerin sonucunda; MDA-MB-436 hücrelerinin Gabra3 ifadesinin MCF-7 hücrelerinin Gabra3 ifadesine göre 20 kat fazla olduğu görülmüştür. Flumazenil uygulamasının tüm konsantrasyonlarında ise MDA-MB-436 hücrelerinin Gabra3 ekspresyonunun arttığı belirlenmiştir. Yapılan 0,01 μM ve 1 μM flumazenil uygulaması Gabra3 ifadesini MDA-MB-436 kontrol hücrelerine göre sırasıyla 8 ve 10 kat arttırırken, yüksek konsantrasyondaki 10 μM ve 100 μM flumazenil uygulaması ise kontrole kıyasla Gabra3 geninin ifadesini sırasıyla 0,5 ve 1 kat oranında arttırmıştır. Flumazenilin Gabra3 üzerindeki etkisine bağlı olarak meme kanserinde kullanımının daha ileri çalışmalarla belirlenmesi gerekmektedir.