Prof. Dr. Dilek Balık danışmanlığındaki tezler
13 tez · Yıldız Technical University
Bronkopulmoner displazi ile ilişkilendirilen belirli genlerdeki polimorfizmlerin Türk populasyonu üzerinde incelenmesi
Bronkopulmoner displazi (BPD), preterm infantlarda en sık görülen kronik akciğer hastalıklarından biridir. Merkezlerin kronik akciğer hastalığı ve BPD tanımlarının farklılıklarından dolayı BPD insidansı da merkezlere göre değişkenlik gösterse de çoğu Avrupa ülkesine göre, hamileliğin 30. haftasından önce doğan preterm infantların %30'undan fazlasına BPD teşhisi konmaktadır. BPD geliştirme eğilimi olan preterm infantlar, akciğer gelişiminin geç kanaliküler veya erken sakküler evresinde doğarlar ve sonuçta alveol sayıları matür bebeklere göre daha az olur. Günümüzde enflamasyon ve özellikle prematürite ile birlikte alveol gelişimindeki duraklama, sürfaktan eksikliği ve göğüs duvarının olgunlaşmaması BPD'nin en önemli etiyolojik faktörleri olarak görülmektedirler. BPD, genetik ve çevresel faktörlerin (hiperoksi, invazif mekanik ventilasyon ve sepsis) karşılıklı etkileşimi sonucunda meydana gelmektedir. Literatürde BPD riskine etki eden genetik faktörler ikiz çalışmaları, ailesel birikim, genom çapında ilişkilendirme çalışmaları (genome wide association studies, GWAS) ve hedef genlerde tek nükleotid polimorfizmleri (single nucleotide polymorphism, SNP) gibi farklı yaklaşımlar ile araştırılmaktadır. Bu tez çalışmasında, dünyada farklı populasyonlar üzerinde yapılmış çalışmalarda bronkopulmoner displazi (BPD) ile ilişkilendirilmiş bazı SNP'ler seçilerek, Türk populasyonunda da bu SNP allel ve genotip frekanslarının görülüp görülmediğinin multipleks reaksiyonlar ve MALDI-TOF kütle spektrometrisi yöntemi ile belirlenmiştir. Elde edilen veriler ayrıca hastaların klinik ve demografik bilgileri ile de karşılaştırılarak anlamlı bir ilişki kurulmaya çalışılmış ve BPD'nin Türk toplumuna özgü genetik tabanının anlaşılabilmesine katkıda bulunulması amaçlanmıştır. 96'sı BPD hastası, toplam 192 prematüre infanttan toplanan kan örneklerinden genotiplenen 45 SNP bölgesi arasından rs11003125, rs2233406, rs3138053, rs55716084 ve rs62468577 polimorfizmlerinin allel düzeyinde; rs4883955, rs833061 ve rs9953270 polimorfizmlerinin ise hem allel hem de genotip düzeyinde Türk populasyonunda BPD insidansı ile istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki içerisinde olduğu saptanmıştır. Bununla birlikte hastalardan toplanan klinik ve demografik verilerin araştırılan SNP'ler ile olan ilişkileri incelendiğinde ise pek çok polimorfizmin ailede görülen kronik akciğer, zatürre, BPD, RDS ve sigara kullanımı öyküsü ile anlamlı bir ilişki içerisinde olduğu bulunmuştur. Sonuç olarak bu tez çalışması ile toplumumuz için ilk kez BPD hastalığının genetik altyapısının araştırılması amacıyla çoklu polimorfizm bölgeleri yüksek doğruluk ile genotiplenerek BPD insidansı ile ilişkileri ortaya konmuştur.
Theileria annulata'nın enolaz enzimini kodlayan genin intronsuz olarak klonlanması, enzimin ifade edilmesi, saflaştırılması ve kinetik karakterizasyonu
Tropikal theilorisis, Hyalomma cinsi kenelerce taşınan apikompleksan paraziti Theileria annulata aracılığıyla yüksek verimli sığırlarda enfeksiyona ve yüksek oranda morbidite ve mortaliteye neden olmaktadır. Bu nedenle tropikal theilorisis büyük ekonomik kayıplara neden olan yaygın ve önemli bir hastalıktır. Son yıllarda parazitin hastalığın tedavisinde kullanılan en etkin ilaca karşı direnç geliştirdiği bildirilmiştir. Bu durum, alternatif tedavi yöntemlerine ihtiyaç doğurmuştur. Glikolizis, Theileria annulata'nın ATP eldesinde, canlılığı ve virülansında çok önemli bir rol oynamaktadır. Bu nedenle bu yolak, antitheilerial ilaçlar için aday olan hedeflerdendir. Enolaz 2-fosfogliserikasidin (2-PGA) ve fosfoenolpirüvatın (PEP) tersinir dönüşümünü katalizleyen kilit bir glikolitik enzimdir. Ayrıca, son yayınlar ile enolazın, bazı patojenik organizmaların hücre yüzeyinde ifade edildiği belirtilmiştir. Hücre yüzeyindeki enolaz, plazminojen bağlanma reseptörü olarak görev almakta ve dokuya invazyonda önemli bir rol oynamaktadır. Enolaz, Theileria annulata için kilit bir glikolitik enzim ve plazminojen bağlanma reseptörü olması olmasından dolayı, tropikal theilorisis tedavisinde makromoleküler bir hedef olarak seçilebilir. Bu çalışmada Theileria annulata'nın enolaz enzimini kodlayan gendeki intron dizisi PCR temelli yönlendirilmiş mutagenez ile uzakkalştırılmış ve bu gen pGEM-T Easy vektörüne klonlanmıştır. İntronun uzaklaştırılması DNA dizi analizi ile onaylanmıştır. Bu gen daha sonra C-terminalinde 6 Histag kuyruğu içeren pLATE31 vektörüne altklonlamış ve Escherichia coli BL21(DE3) hücrelerinde ifade edilmiştir. İfade edilen enzim Ni-NTA agaroz kolon kullanılarak afinite kromatografisi aracılığıyla saflaştırılmıştır. Enzime ait kararlı hal kinetik verileri GraFit 3.0 ile tanımlanmıştır. Theileria annulata'ya ait RNA örneğinin yokluğundan dolayı, yapıya dayandırılmış ilaç tasarımı çalışmalarına uygun olacak aktif enzimin üretilmesi için, gendeki intron dizisinin uzaklaştırılmasında PCR temelli yönlendirilmiş mutagenez kullanılarak bir strateji geliştirilmiştir. Bilgimiz dahilinde, bu çalışma orjinal intron dizisini içeren genden aktif enzimin üretilmesi amacıyla ilk kez uygulanmıştır. Aktif enzimin ifadesi ve saflaştırılması yeni ilaç tasarım çalışmaları ve hastalığın yok edilme stratejileri için önemlidir. İntron uzaklaştırılmasını takiben saf rekombinant Theileria annulata enolazının yüksek miktarda eldesi (30 mg/litre kültür) yüksek saflık derecesinde (>% 95) sağlanmıştır. Saflaştırılan proteinin molekül ağırlığı SDS-PAGE'te amino asit sekansından hesaplanan kütle doğrulaması ile yaklaşık olarak 48 kDa büyüklüğünde tek bant vermiştir. 2-PGA'nın substrat olarak kullanıldığı enzim aktivite ölçümleri, spesifik aktivite değerini 43 U/mg, Km=106 µM, Vmax=0,132, kcat=37 s-1 ve kcat/Km=3,5x105 M-1.s-1 olarak vermiştir. Bu değerler bu parazit için ilk defa tanımlanmıştır ve enolaz enziminin büyük miktarlarda eldesi yeni antitheilerial ilaçların tasarımına yönelik daha ileri kinetik ve yapısal karakterizasyon çalışmalarına olanak sağlayacaktır.
Theileria annulata'nın enolaz enzimini kodlayan genin intronsuz olarak klonlanması, enzimin ifade edilmesi, saflaştırılması ve kinetik karakterizasyonu
Tropikal theilorisis, Hyalomma cinsi kenelerce taşınan apikompleksan paraziti Theileria annulata aracılığıyla yüksek verimli sığırlarda enfeksiyona ve yüksek oranda morbidite ve mortaliteye neden olmaktadır. Bu nedenle tropikal theilorisis büyük ekonomik kayıplara neden olan yaygın ve önemli bir hastalıktır. Son yıllarda parazitin hastalığın tedavisinde kullanılan en etkin ilaca karşı direnç geliştirdiği bildirilmiştir. Bu durum, alternatif tedavi yöntemlerine ihtiyaç doğurmuştur. Glikolizis, Theileria annulata'nın ATP eldesinde, canlılığı ve virülansında çok önemli bir rol oynamaktadır. Bu nedenle bu yolak, antitheilerial ilaçlar için aday olan hedeflerdendir. Enolaz 2-fosfogliserikasidin (2-PGA) ve fosfoenolpirüvatın (PEP) tersinir dönüşümünü katalizleyen kilit bir glikolitik enzimdir. Ayrıca, son yayınlar ile enolazın, bazı patojenik organizmaların hücre yüzeyinde ifade edildiği belirtilmiştir. Hücre yüzeyindeki enolaz, plazminojen bağlanma reseptörü olarak görev almakta ve dokuya invazyonda önemli bir rol oynamaktadır. Enolaz, Theileria annulata için kilit bir glikolitik enzim ve plazminojen bağlanma reseptörü olması olmasından dolayı, tropikal theilorisis tedavisinde makromoleküler bir hedef olarak seçilebilir. Bu çalışmada Theileria annulata'nın enolaz enzimini kodlayan gendeki intron dizisi PCR temelli yönlendirilmiş mutagenez ile uzakkalştırılmış ve bu gen pGEM-T Easy vektörüne klonlanmıştır. İntronun uzaklaştırılması DNA dizi analizi ile onaylanmıştır. Bu gen daha sonra C-terminalinde 6 Histag kuyruğu içeren pLATE31 vektörüne altklonlamış ve Escherichia coli BL21(DE3) hücrelerinde ifade edilmiştir. İfade edilen enzim Ni-NTA agaroz kolon kullanılarak afinite kromatografisi aracılığıyla saflaştırılmıştır. Enzime ait kararlı hal kinetik verileri GraFit 3.0 ile tanımlanmıştır. Theileria annulata'ya ait RNA örneğinin yokluğundan dolayı, yapıya dayandırılmış ilaç tasarımı çalışmalarına uygun olacak aktif enzimin üretilmesi için, gendeki intron dizisinin uzaklaştırılmasında PCR temelli yönlendirilmiş mutagenez kullanılarak bir strateji geliştirilmiştir. Bilgimiz dahilinde, bu çalışma orjinal intron dizisini içeren genden aktif enzimin üretilmesi amacıyla ilk kez uygulanmıştır. Aktif enzimin ifadesi ve saflaştırılması yeni ilaç tasarım çalışmaları ve hastalığın yok edilme stratejileri için önemlidir. İntron uzaklaştırılmasını takiben saf rekombinant Theileria annulata enolazının yüksek miktarda eldesi (30 mg/litre kültür) yüksek saflık derecesinde (>% 95) sağlanmıştır. Saflaştırılan proteinin molekül ağırlığı SDS-PAGE'te amino asit sekansından hesaplanan kütle doğrulaması ile yaklaşık olarak 48 kDa büyüklüğünde tek bant vermiştir. 2-PGA'nın substrat olarak kullanıldığı enzim aktivite ölçümleri, spesifik aktivite değerini 43 U/mg, Km=106 µM, Vmax=0,132, kcat=37 s-1 ve kcat/Km=3,5x105 M-1.s-1 olarak vermiştir. Bu değerler bu parazit için ilk defa tanımlanmıştır ve enolaz enziminin büyük miktarlarda eldesi yeni antitheilerial ilaçların tasarımına yönelik daha ileri kinetik ve yapısal karakterizasyon çalışmalarına olanak sağlayacaktır.
Theileria annulata'nın enolaz enzimini kodlayan genin intronsuz olarak klonlanması, enzimin ifade edilmesi, saflaştırılması ve kinetik karakterizasyonu
Tropikal theilorisis, Hyalomma cinsi kenelerce taşınan apikompleksan paraziti Theileria annulata aracılığıyla yüksek verimli sığırlarda enfeksiyona ve yüksek oranda morbidite ve mortaliteye neden olmaktadır. Bu nedenle tropikal theilorisis büyük ekonomik kayıplara neden olan yaygın ve önemli bir hastalıktır. Son yıllarda parazitin hastalığın tedavisinde kullanılan en etkin ilaca karşı direnç geliştirdiği bildirilmiştir. Bu durum, alternatif tedavi yöntemlerine ihtiyaç doğurmuştur. Glikolizis, Theileria annulata'nın ATP eldesinde, canlılığı ve virülansında çok önemli bir rol oynamaktadır. Bu nedenle bu yolak, antitheilerial ilaçlar için aday olan hedeflerdendir. Enolaz 2-fosfogliserikasidin (2-PGA) ve fosfoenolpirüvatın (PEP) tersinir dönüşümünü katalizleyen kilit bir glikolitik enzimdir. Ayrıca, son yayınlar ile enolazın, bazı patojenik organizmaların hücre yüzeyinde ifade edildiği belirtilmiştir. Hücre yüzeyindeki enolaz, plazminojen bağlanma reseptörü olarak görev almakta ve dokuya invazyonda önemli bir rol oynamaktadır. Enolaz, Theileria annulata için kilit bir glikolitik enzim ve plazminojen bağlanma reseptörü olması olmasından dolayı, tropikal theilorisis tedavisinde makromoleküler bir hedef olarak seçilebilir. Bu çalışmada Theileria annulata'nın enolaz enzimini kodlayan gendeki intron dizisi PCR temelli yönlendirilmiş mutagenez ile uzakkalştırılmış ve bu gen pGEM-T Easy vektörüne klonlanmıştır. İntronun uzaklaştırılması DNA dizi analizi ile onaylanmıştır. Bu gen daha sonra C-terminalinde 6 Histag kuyruğu içeren pLATE31 vektörüne altklonlamış ve Escherichia coli BL21(DE3) hücrelerinde ifade edilmiştir. İfade edilen enzim Ni-NTA agaroz kolon kullanılarak afinite kromatografisi aracılığıyla saflaştırılmıştır. Enzime ait kararlı hal kinetik verileri GraFit 3.0 ile tanımlanmıştır. Theileria annulata'ya ait RNA örneğinin yokluğundan dolayı, yapıya dayandırılmış ilaç tasarımı çalışmalarına uygun olacak aktif enzimin üretilmesi için, gendeki intron dizisinin uzaklaştırılmasında PCR temelli yönlendirilmiş mutagenez kullanılarak bir strateji geliştirilmiştir. Bilgimiz dahilinde, bu çalışma orjinal intron dizisini içeren genden aktif enzimin üretilmesi amacıyla ilk kez uygulanmıştır. Aktif enzimin ifadesi ve saflaştırılması yeni ilaç tasarım çalışmaları ve hastalığın yok edilme stratejileri için önemlidir. İntron uzaklaştırılmasını takiben saf rekombinant Theileria annulata enolazının yüksek miktarda eldesi (30 mg/litre kültür) yüksek saflık derecesinde (>% 95) sağlanmıştır. Saflaştırılan proteinin molekül ağırlığı SDS-PAGE'te amino asit sekansından hesaplanan kütle doğrulaması ile yaklaşık olarak 48 kDa büyüklüğünde tek bant vermiştir. 2-PGA'nın substrat olarak kullanıldığı enzim aktivite ölçümleri, spesifik aktivite değerini 43 U/mg, Km=106 µM, Vmax=0,132, kcat=37 s-1 ve kcat/Km=3,5x105 M-1.s-1 olarak vermiştir. Bu değerler bu parazit için ilk defa tanımlanmıştır ve enolaz enziminin büyük miktarlarda eldesi yeni antitheilerial ilaçların tasarımına yönelik daha ileri kinetik ve yapısal karakterizasyon çalışmalarına olanak sağlayacaktır.
Fusobacterium nucleatum laktat dehidrogenaz enzimini kodlayan genin izolasyonu, klonlanması ve analizi
Birçok iltihaplı hastalıklara sebep olan Fusobacterium nucleatum fusobakteri ailesinden, gram negatif ve obligatif anaerob bakteridir. İnvaziv ve pro-inflamatuar etkiye sahip bu anaerobik bakteri kolorektal karsionama, periodontal hastalıklar ve perikardit gibi birçok yumuşak doku hastalığına sebep olmaktadır. Dünya sağlık örgütünün raporlarında göre, Fusobacterium nucleatum kaynaklı kolorektal kanser vakalarında 610.000'e yakın ölüme neden olmaktadır. Bu sebeple bakteriyel infeksiyonu baskılamak amacıyla F. nucleatum'un metabolizmasının bilinmesi gerekmektedir. Laktat dehidrogenaz enzimi anaerobik glikolizis ve hücre içi biyomoleküllerin üretiminde önemli rol oynamaktadır. Bu enzim yeni ilaç tasarım çalışmalarında muhtemel hedef molekül seçilmiştir. Bu tez çalışmasında laktat dehidrogenaz enzimini kodlayan gen Fusobacterium nucleatum genomik DNA'sından izole edilmiş, PCR ile amplifiye edilmiştir ve literatürde ilk defa standart protokol uygulanarak pGEM-T easy vector sistemine klonlanmıştır. Klonlanan Fusobacterium nucleatum laktat dehidrogenaz (FnLDH) enzimini kodlayan gen nükleotit ve aminoasit düzeyinde analiz edilmiştir. FnLDH aminoasit dizisinin insandaki eşdeğeri olan LDH ile çakıştırılması ile 98-109 residüleri arasındaki enzimin aktif bölgesi önemli farklılıklar göstermiştir. Gen ifadesi için FnLDH geni ekspresyon vektörü olan pKK223-3 vektörüne alt-klonlama yapılmış ve E. coli JM109 hücresinde ifadesi yapılmıştır. Hücrelerin sonikasyonu sonrası supernatant kısmında az miktarda protein gözlemlenmiş ve enzimin çoğu pellet kısmında bulunmuştur. Uygun sistemlerde gen ifadesi sonrası aktif ve çözünebilir fazda protein üretimi, yapıya dayandırılmış ilaç tasarım çalışmalarında oldukça önemlidir. Yapılan SDS-PAGE analizi sonucu 34.697 Da moleküler ağırlıktaki protein gözlemlenmiştir fakat yeterli miktarda üretim ve aktif enzim olmadığından, aLICator LIC ekspresyon sisteminin avantajlarından yararlanmak amacıyla FnLDH geni pLATE31 vektörüne klonlanmıştır. Çözünebilir fraksiyonda başarılı bir şekilde ifade edilmiş ve Ni-NTA agaroz kolonu kullanılarak % 95 oranında saflaştırılabilmiştir. Saflaştırılan 34.697 Da molekül ağırlığındaki FnLDH SDS-PAGE'de analiz edilmiştir. Saflaştırılan FnLDH enziminin spesifik aktivitesi, NADH ve piruvat kullanılarak ölçülmüştür ve daha sonraki kinetik analizler için yeterli aktivite görülmüştür. Çalışmamızda üç boyutlu kristal yapısı bilinen Lactobacillus casei L-laktat dehidrogenaz kalıp alınarak Fusobacterium nucleatum laktat dehidrogenaz enzimi için bir model oluşturulmuştur. Bu iki enzim arasındaki benzerlik %41'dir. Proteinlerin üç boyutlu yapısını modellemek için karşılaştırmalı modelleme prensibine dayanan homoloji modelleme yöntemi kullanılmıştır. Oluşturulan 3D yapısı MODELLER programı kullanılarak yapılandırılmıştır. Bu program yapısı belirlenmek istenen yapı ile bilinen yapıları karşılaştırarak model oluşturur. 3D boyutlu yapı ile ilgili değerlendirmeler ve düzeltmeler web tabanlı ERRAT, PROSA, HYPERCHEM ve RAMPAGE kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Proteindeki muhtemel ligand bağlanma bölgeleri web tabanlı SiteFinder, Pocket-Finder ve DoGSiteScorer programları kullanılarak belirlenmiştir. 98-109 arası residüler ligandın bağlanması için en uygun bölge olduğu ve bu bölgenin insan kas LDH'ında eşdeğer bölgesinden farklılık gösterdiği tespit edilmiştir. Mevcut çalışma Fusobacterium nucleatum'un enerji metabolizmasında laktat dehidrogenaz enziminin rolünün ve yapıya dayandırılmış ilaç tasarım çalışmalarında kullanılabilir uygulamaların anlaşılmasına yardımcı olabileceği düşünülmektedir.
Toplumumuzda ankilozan spondilit hastalığına genetik yatkınlığın kütle spektroskopisi ile belirlenmesi
Ankilozan spondilit (AS), omurga ve periferik eklemlerin tutulduğu özellikle aksiyal eklemlerde hareket kısıtlılığına neden olan sistemik, kronik ve inflamatuar bir hastalıktır. Hastalığın gelişiminde genetik, çevresel ve immünolojik birçok faktör rol almaktadır. Hastalarda işgücü kaybına ve yaşam kalitesinde azalmaya neden olan AS'nin prevelansı %0,15 - 0,49'dur. Tek Nükleotid Polimorfizmi (SNP) insan genomunda yüksek sıklıkta görülen tek baz değişimleri olup; hastalığa yatkınlık, hastalığın gelişimi, ilaç yanıtı ve hastalıkların tanısında yararlanılan önemli moleküler belirteçlerdir. Farklı toplumlarda yapılan çalışmalarda hastalık riski ve bazı SNP'ler ilişkilendirilmiştir. Bu SNP'lerin çalışılması, hastalık tanısının erken dönemde ve omurga deformasyonu gerçekleşmeden konulmasına katkı sunacaktır. Yapılan bu çalışmada farklı toplumlarda AS ile ilişkilendirilen 7 farklı gen bölgesi ve 3 genler arası bölgede olmak üzere toplam 21 SNP'nin AS hastalık riski ile ilişkisi genotip ve allel düzeyinde araştırılmıştır. 101 kontrol ve AS'li 100 hasta ile gerçekleştirilen çalışmada tespit edilen 21 SNP'nin genotiplenmesinde iPLEX® yöntemi kullanılmıştır. Çalışmada elde edilen veriler Ki-kare, Fischer kesinlik testi ve lojistik regresyon analizi ile değerlendirilmiştir (p≤0.5, OR>1). Bu tez çalışması ile toplumuzda ilk defa 6. Kromozom üzerinde HLA-S ve DHFR2 psödogen bölgeleri arasında yer alan rs7743761 polimorfizminin allel (A alleli için p=0.002, OR=1.90 %95GA=1.26-2.87) ve genotip (CA genotipi için p<0.0001, OR=4.93 %95GA=2.437-9.986) düzeyinde AS hastalık riski ile ilişkili olduğu tespit edilmiştir. Çalışma ile bazı klinik ve demografik değişkenlerin hastalık durumuna katkıları ki-kare ve Fischer kesinlik testi ile analiz edilmiş; ailede romatizmal hastalık öyküsü (p=0.003), ailede AS hastalık olgusu (p<0.001), ailede bel fıtığı hastalık öyküsü (p<0.001) ve cinsiyet (p=0.001) değişkenlerinin AS hastası olma durumu ile ilişkili olduğu tespit edilmiştir. Çalışmada aynı zamanda klinik değişkenler ile SNP'lere ait genotipler ki-kare ve Fischer kesinlik testi ile hastalık riski açısından analiz edildiğinde; ailede romatizmal hastalık öyküsü ile rs868213 (p=0.037), ailede bel fıtığı olgusu ile rs1004819 (p=0.032), rs10889677 (p=0.017) ve rs11465804 (p=0.043) polimorfizmlerinin hastalık riski ile ilişkili olduğu tespit edilmiştir. Lojistik regresyon analizi ile SNP genotipleri ve klinik-demografik değişkenler hastalık riski açısından analiz edildiğinde; rs7743761 (p=0.003, OR=3.493 %95GA=1.534-7.955), ailede bel fıtığı olgusu (p<0.001, OR=4.710 %95GA=2.047-10.834), ailede AS olgusu (p<0.001, OR=53.752 %95GA=6.916-417.767) ve cinsiyet (p=0.007, OR=2.671 %95GA=1.309-5.451) değişkenlerinin hastalık riski ile ilişkili olduğu tespit edilmiştir. Sonuç olarak; toplumumuzda ilk defa rs7743761 polimorfizmi hastalık riski ile ilişkilendirilmiş, cinsiyet, ailede bel fıtığı ve ailede AS olgularının hastalık riskine etkileri gösterilmiş ve elde edilen bilgilerin biyomarkır olarak geliştirilme potansiyelinin olduğu tespit edilmiştir.
Toplumumuzda ankilozan spondilit hastalığına genetik yatkınlığın kütle spektroskopisi ile belirlenmesi
Ankilozan spondilit (AS), omurga ve periferik eklemlerin tutulduğu özellikle aksiyal eklemlerde hareket kısıtlılığına neden olan sistemik, kronik ve inflamatuar bir hastalıktır. Hastalığın gelişiminde genetik, çevresel ve immünolojik birçok faktör rol almaktadır. Hastalarda işgücü kaybına ve yaşam kalitesinde azalmaya neden olan AS'nin prevelansı %0,15 - 0,49'dur. Tek Nükleotid Polimorfizmi (SNP) insan genomunda yüksek sıklıkta görülen tek baz değişimleri olup; hastalığa yatkınlık, hastalığın gelişimi, ilaç yanıtı ve hastalıkların tanısında yararlanılan önemli moleküler belirteçlerdir. Farklı toplumlarda yapılan çalışmalarda hastalık riski ve bazı SNP'ler ilişkilendirilmiştir. Bu SNP'lerin çalışılması, hastalık tanısının erken dönemde ve omurga deformasyonu gerçekleşmeden konulmasına katkı sunacaktır. Yapılan bu çalışmada farklı toplumlarda AS ile ilişkilendirilen 7 farklı gen bölgesi ve 3 genler arası bölgede olmak üzere toplam 21 SNP'nin AS hastalık riski ile ilişkisi genotip ve allel düzeyinde araştırılmıştır. 101 kontrol ve AS'li 100 hasta ile gerçekleştirilen çalışmada tespit edilen 21 SNP'nin genotiplenmesinde iPLEX® yöntemi kullanılmıştır. Çalışmada elde edilen veriler Ki-kare, Fischer kesinlik testi ve lojistik regresyon analizi ile değerlendirilmiştir (p≤0.5, OR>1). Bu tez çalışması ile toplumuzda ilk defa 6. Kromozom üzerinde HLA-S ve DHFR2 psödogen bölgeleri arasında yer alan rs7743761 polimorfizminin allel (A alleli için p=0.002, OR=1.90 %95GA=1.26-2.87) ve genotip (CA genotipi için p<0.0001, OR=4.93 %95GA=2.437-9.986) düzeyinde AS hastalık riski ile ilişkili olduğu tespit edilmiştir. Çalışma ile bazı klinik ve demografik değişkenlerin hastalık durumuna katkıları ki-kare ve Fischer kesinlik testi ile analiz edilmiş; ailede romatizmal hastalık öyküsü (p=0.003), ailede AS hastalık olgusu (p<0.001), ailede bel fıtığı hastalık öyküsü (p<0.001) ve cinsiyet (p=0.001) değişkenlerinin AS hastası olma durumu ile ilişkili olduğu tespit edilmiştir. Çalışmada aynı zamanda klinik değişkenler ile SNP'lere ait genotipler ki-kare ve Fischer kesinlik testi ile hastalık riski açısından analiz edildiğinde; ailede romatizmal hastalık öyküsü ile rs868213 (p=0.037), ailede bel fıtığı olgusu ile rs1004819 (p=0.032), rs10889677 (p=0.017) ve rs11465804 (p=0.043) polimorfizmlerinin hastalık riski ile ilişkili olduğu tespit edilmiştir. Lojistik regresyon analizi ile SNP genotipleri ve klinik-demografik değişkenler hastalık riski açısından analiz edildiğinde; rs7743761 (p=0.003, OR=3.493 %95GA=1.534-7.955), ailede bel fıtığı olgusu (p<0.001, OR=4.710 %95GA=2.047-10.834), ailede AS olgusu (p<0.001, OR=53.752 %95GA=6.916-417.767) ve cinsiyet (p=0.007, OR=2.671 %95GA=1.309-5.451) değişkenlerinin hastalık riski ile ilişkili olduğu tespit edilmiştir. Sonuç olarak; toplumumuzda ilk defa rs7743761 polimorfizmi hastalık riski ile ilişkilendirilmiş, cinsiyet, ailede bel fıtığı ve ailede AS olgularının hastalık riskine etkileri gösterilmiş ve elde edilen bilgilerin biyomarkır olarak geliştirilme potansiyelinin olduğu tespit edilmiştir.
Toplumumuzda ankilozan spondilit hastalığına genetik yatkınlığın kütle spektroskopisi ile belirlenmesi
Ankilozan spondilit (AS), omurga ve periferik eklemlerin tutulduğu özellikle aksiyal eklemlerde hareket kısıtlılığına neden olan sistemik, kronik ve inflamatuar bir hastalıktır. Hastalığın gelişiminde genetik, çevresel ve immünolojik birçok faktör rol almaktadır. Hastalarda işgücü kaybına ve yaşam kalitesinde azalmaya neden olan AS'nin prevelansı %0,15 - 0,49'dur. Tek Nükleotid Polimorfizmi (SNP) insan genomunda yüksek sıklıkta görülen tek baz değişimleri olup; hastalığa yatkınlık, hastalığın gelişimi, ilaç yanıtı ve hastalıkların tanısında yararlanılan önemli moleküler belirteçlerdir. Farklı toplumlarda yapılan çalışmalarda hastalık riski ve bazı SNP'ler ilişkilendirilmiştir. Bu SNP'lerin çalışılması, hastalık tanısının erken dönemde ve omurga deformasyonu gerçekleşmeden konulmasına katkı sunacaktır. Yapılan bu çalışmada farklı toplumlarda AS ile ilişkilendirilen 7 farklı gen bölgesi ve 3 genler arası bölgede olmak üzere toplam 21 SNP'nin AS hastalık riski ile ilişkisi genotip ve allel düzeyinde araştırılmıştır. 101 kontrol ve AS'li 100 hasta ile gerçekleştirilen çalışmada tespit edilen 21 SNP'nin genotiplenmesinde iPLEX® yöntemi kullanılmıştır. Çalışmada elde edilen veriler Ki-kare, Fischer kesinlik testi ve lojistik regresyon analizi ile değerlendirilmiştir (p≤0.5, OR>1). Bu tez çalışması ile toplumuzda ilk defa 6. Kromozom üzerinde HLA-S ve DHFR2 psödogen bölgeleri arasında yer alan rs7743761 polimorfizminin allel (A alleli için p=0.002, OR=1.90 %95GA=1.26-2.87) ve genotip (CA genotipi için p<0.0001, OR=4.93 %95GA=2.437-9.986) düzeyinde AS hastalık riski ile ilişkili olduğu tespit edilmiştir. Çalışma ile bazı klinik ve demografik değişkenlerin hastalık durumuna katkıları ki-kare ve Fischer kesinlik testi ile analiz edilmiş; ailede romatizmal hastalık öyküsü (p=0.003), ailede AS hastalık olgusu (p<0.001), ailede bel fıtığı hastalık öyküsü (p<0.001) ve cinsiyet (p=0.001) değişkenlerinin AS hastası olma durumu ile ilişkili olduğu tespit edilmiştir. Çalışmada aynı zamanda klinik değişkenler ile SNP'lere ait genotipler ki-kare ve Fischer kesinlik testi ile hastalık riski açısından analiz edildiğinde; ailede romatizmal hastalık öyküsü ile rs868213 (p=0.037), ailede bel fıtığı olgusu ile rs1004819 (p=0.032), rs10889677 (p=0.017) ve rs11465804 (p=0.043) polimorfizmlerinin hastalık riski ile ilişkili olduğu tespit edilmiştir. Lojistik regresyon analizi ile SNP genotipleri ve klinik-demografik değişkenler hastalık riski açısından analiz edildiğinde; rs7743761 (p=0.003, OR=3.493 %95GA=1.534-7.955), ailede bel fıtığı olgusu (p<0.001, OR=4.710 %95GA=2.047-10.834), ailede AS olgusu (p<0.001, OR=53.752 %95GA=6.916-417.767) ve cinsiyet (p=0.007, OR=2.671 %95GA=1.309-5.451) değişkenlerinin hastalık riski ile ilişkili olduğu tespit edilmiştir. Sonuç olarak; toplumumuzda ilk defa rs7743761 polimorfizmi hastalık riski ile ilişkilendirilmiş, cinsiyet, ailede bel fıtığı ve ailede AS olgularının hastalık riskine etkileri gösterilmiş ve elde edilen bilgilerin biyomarkır olarak geliştirilme potansiyelinin olduğu tespit edilmiştir.
Yeni anti-theilerial ilaçların geliştirilmesi için theileria annulata peptidil prolil izomeraz geninin klonlanması ve inhibitör adaylarının in silico incelenmesi
Geleneksel yöntemlerle yeni ilaçların geliştirilmesi pahalıdır ve uzun yıllar sürmektedir. Son yıllarda, bilgisayar destekli ilaç tasarımı, maliyet ve zaman gereksinimlerini önemli ölçüde azalttığı için yeni ilaç keşfi ve geliştirilmesi alanında büyük önem kazanmıştır. T. annulata, dünya çapında milyonlarca sığırı tehdit eden tropikal theileriosise neden olmaktadır. Theileriosisin tedavisinde anti-theilerial ilaç olan buparvaquone kullanılmaktadır. Ancak, son zamanlarda Theileria annulata'nın ilaç direncinin bildirilmesi, theileriosisin tedavi edilmesi için yeni ilaç adaylarının keşfedilmesi ihtiyacını ortaya çıkarmaktadır. Tez çalışmasında, ileri in vitro karakterizasyon ve inhibitör test çalışmalarında kullanılmak üzere Theileria annulata peptidil prolil cis/trans izomeraz geni (TaPIN1) klonlanmış olup, inhibitor kütüphanesi in silico taranarak ilaç direnci rapor edilmiş TaPIN1'in inhibisyonuna yönelik aday moleküllerin belirlenmesi ve önerilen yaklaşımın aşırı ifade edilmiş Ras/Neu proteinlerce indüklenen insan PIN1 enzim kaynaklı kanserlerin tedavi edilmesine yönelik kurgunun yapılması gerçekleştirilmiştir. Tez çalışmasının klonlama aşamasında ilk olarak, Theileria annulata peptidil prolil cis/trans izomeraz enzimini kodlayan dizi polimeraz zincir reaksiyonu ile amplifiye edilmiştir. Ardından, pLATE31 vektör sistemine aktarılarak, E. coli BL21 (DE3) hücrelerine transformasyonu gerçekleştirilmiştir. İntron bölgesi, Q5® Site-Directed Mutagenesis Kit ile uzaklaştırılıp intronsuz rekombinant DNA E. coli BL21 (DE3) hücrelerine transforme edilmiştir. İntronun uzaklaştırıldığı ve doğru gen dizisinin insersiyonu, DNA dizilime ile teyit edilmiş ve ileri çalışmlar için hazır hale getirilmiştir. Tez çalışmasının bilgisayar destekli ilaç keşfi aşamasının ilk adımında, mutant ve yabanıl tip TaPIN1'in homoloji modelleri, MODELLER v9.15 yazılımı ile belirlenmiş olup, modellerin doğruluğu, çeşitli web sunucuları kullanılarak teyit edilmiştir. PubChem veri bankası kullanılarak oluşturulan 2979 naftokinon türevlerini içeren sanal kütüphane mutant TaPIN1'e karşı Schrödinger Glide HTVS, SP ve XP kenetlenme metodolojilerine göre taranmıştır. Kenetli bileşikler Glide Extra Precision (XP) skorlama fonksiyonu ile sıralanmış ve serbest bağlanma enerjileri Prime MM-GBSA yöntemi ile hesaplanmıştır. XP skor sıralamasına göre ilk iki sırada yer alan kenetli bileşikler (5304752 ve 9993782 Pubchem numaralı bileşikler) moleküler dinamik simülasyon çalışmalarında kullanılmıştır. AMBER programı kullanılarak, ligand bağlı olmadan yabanıl tip ve mutant TaPIN1'in simülasyonu 50 ns, ligand bağlı yapıların simülasyonu 100 ns'de gerçekleştirilmiştir. 5304752 PubChem numaralı ligandın hem yabanıl tip hem mutant TaPIN1'in aktif bölgesinde bulunduğu gözlenmiştir ve potansiyel inhibitör olarak değerlendirilebileceği öngörülmüştür. 9993782 PubChem numaralı ligandın yabanıl tip TaPIN1'in aktif bölgesinin dışında konumlandığı gözlenmiştir, fakat mutant TaPIN1'in aktif bölgesine yakın bir yerde bulunduğu gözlenmiştir ve mutant enzime karşı potansiyel inhibitör olarak değerlendirilebileceği öngörülmüştür. Ayrıca, bu sonuçlar doğrultusunda, öngörülen inhibitörler, TaPIN1 ile aynı mekanizmayı kullanarak, insanlarda kanser oluşumuna neden olan insan peptidil prolil enzimi (hPIN1) için de potansiyel inhibitörler olabileceği öngörülmüştür.
Yeni anti-theilerial ilaçların geliştirilmesi için theileria annulata peptidil prolil izomeraz geninin klonlanması ve inhibitör adaylarının in silico incelenmesi
Geleneksel yöntemlerle yeni ilaçların geliştirilmesi pahalıdır ve uzun yıllar sürmektedir. Son yıllarda, bilgisayar destekli ilaç tasarımı, maliyet ve zaman gereksinimlerini önemli ölçüde azalttığı için yeni ilaç keşfi ve geliştirilmesi alanında büyük önem kazanmıştır. T. annulata, dünya çapında milyonlarca sığırı tehdit eden tropikal theileriosise neden olmaktadır. Theileriosisin tedavisinde anti-theilerial ilaç olan buparvaquone kullanılmaktadır. Ancak, son zamanlarda Theileria annulata'nın ilaç direncinin bildirilmesi, theileriosisin tedavi edilmesi için yeni ilaç adaylarının keşfedilmesi ihtiyacını ortaya çıkarmaktadır. Tez çalışmasında, ileri in vitro karakterizasyon ve inhibitör test çalışmalarında kullanılmak üzere Theileria annulata peptidil prolil cis/trans izomeraz geni (TaPIN1) klonlanmış olup, inhibitor kütüphanesi in silico taranarak ilaç direnci rapor edilmiş TaPIN1'in inhibisyonuna yönelik aday moleküllerin belirlenmesi ve önerilen yaklaşımın aşırı ifade edilmiş Ras/Neu proteinlerce indüklenen insan PIN1 enzim kaynaklı kanserlerin tedavi edilmesine yönelik kurgunun yapılması gerçekleştirilmiştir. Tez çalışmasının klonlama aşamasında ilk olarak, Theileria annulata peptidil prolil cis/trans izomeraz enzimini kodlayan dizi polimeraz zincir reaksiyonu ile amplifiye edilmiştir. Ardından, pLATE31 vektör sistemine aktarılarak, E. coli BL21 (DE3) hücrelerine transformasyonu gerçekleştirilmiştir. İntron bölgesi, Q5® Site-Directed Mutagenesis Kit ile uzaklaştırılıp intronsuz rekombinant DNA E. coli BL21 (DE3) hücrelerine transforme edilmiştir. İntronun uzaklaştırıldığı ve doğru gen dizisinin insersiyonu, DNA dizilime ile teyit edilmiş ve ileri çalışmlar için hazır hale getirilmiştir. Tez çalışmasının bilgisayar destekli ilaç keşfi aşamasının ilk adımında, mutant ve yabanıl tip TaPIN1'in homoloji modelleri, MODELLER v9.15 yazılımı ile belirlenmiş olup, modellerin doğruluğu, çeşitli web sunucuları kullanılarak teyit edilmiştir. PubChem veri bankası kullanılarak oluşturulan 2979 naftokinon türevlerini içeren sanal kütüphane mutant TaPIN1'e karşı Schrödinger Glide HTVS, SP ve XP kenetlenme metodolojilerine göre taranmıştır. Kenetli bileşikler Glide Extra Precision (XP) skorlama fonksiyonu ile sıralanmış ve serbest bağlanma enerjileri Prime MM-GBSA yöntemi ile hesaplanmıştır. XP skor sıralamasına göre ilk iki sırada yer alan kenetli bileşikler (5304752 ve 9993782 Pubchem numaralı bileşikler) moleküler dinamik simülasyon çalışmalarında kullanılmıştır. AMBER programı kullanılarak, ligand bağlı olmadan yabanıl tip ve mutant TaPIN1'in simülasyonu 50 ns, ligand bağlı yapıların simülasyonu 100 ns'de gerçekleştirilmiştir. 5304752 PubChem numaralı ligandın hem yabanıl tip hem mutant TaPIN1'in aktif bölgesinde bulunduğu gözlenmiştir ve potansiyel inhibitör olarak değerlendirilebileceği öngörülmüştür. 9993782 PubChem numaralı ligandın yabanıl tip TaPIN1'in aktif bölgesinin dışında konumlandığı gözlenmiştir, fakat mutant TaPIN1'in aktif bölgesine yakın bir yerde bulunduğu gözlenmiştir ve mutant enzime karşı potansiyel inhibitör olarak değerlendirilebileceği öngörülmüştür. Ayrıca, bu sonuçlar doğrultusunda, öngörülen inhibitörler, TaPIN1 ile aynı mekanizmayı kullanarak, insanlarda kanser oluşumuna neden olan insan peptidil prolil enzimi (hPIN1) için de potansiyel inhibitörler olabileceği öngörülmüştür.
İlaç yeniden konumlandırmanın in silico ve in vitro uygulaması
Meme kanseri dünya çapında kadınlar arasında en sık rastlanan kanser türüdür. Yapılan son kanser istatistiklerine göre; meme kanseri 2017 yılında kadınlarda tanısı koyulan kanserlerin %30'unu oluşturarak, en yüksek görülme sıklığına sahiptir. Bu hastalık, nüfus üzerindeki büyük etkisi nedeniyle, kritik bir sağlık sorununu temsil etmekte ve erken tanı ve tedavisi için moleküler seviyede daha fazla araştırma yapılmasını gerektirmektedir. Meme kanseri hastalarının sağ kalım oranını etkileyen en önemli faktörlerden biri metastazdır. Yakın zamanda yayınlanan bir makale ile normal şartlarda sadece beyinde ifade edildiği düşünülen GABAA reseptör alfa3 (Gabra3)'ün meme kanseri hücrelerinin metastazında kritik bir rol aldığı kanıtlanmıştır. Ayrıca Gabra3'ün normal meme epitelyal hücrelerinde ifade edilmediği yapılan birçok çalışma sayesinde bilinmektedir. Bu tez çalışmasında; MCF-7 ve MDA-MB-436 kanser hücre hatlarındaki Gabra3 ifadesinin incelenmesi ve bir GABA antagonisti olan flumazenil molekülünün MDA-MB-436 meme kanseri hücrelerine karşı etkisinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Bu amaç doğrultusunda, Gabra3/Gabrg2 dimeri modellenmiş ve bilgimiz dahilinde, literatürde ilk kez flumazenil ve Gabra3/Gabrg2 dimerinin moleküler kenetlenme çalışması yapılmıştır. Gabra3/Gabrg2 dimerinin moleküler kenetlenme analizlerinde uygulanan bütün programlar için altyapı olarak Maestro Molecular Modeling Interface 11.3 (Schrödinger Release 2017-3: Maestro, Schrödinger, LLC, New York, NY, 2017) kullanılmıştır. Yapılan SP (Standart precision) ve XP (Extra precision) Glide moleküler kenetlenme çalışmaları sonucunda flumazenilin Gabra3/Gabrg2 dimerine XP metotunda -6.229, SP metotu ile ise -7.167 skoru ile bağlandığı belirlenmiştir. Ardından bu bağlanmanın in vitro etkisini gözlemlemek için MCF-7 ve MDA-MB-436 hücrelerinin kültürü yapılmıştır. MDA-MB-436 hücrelerine 0,01 µM, 1 µM, 10 µM ve 100 µM kosantrasyonlarındaki flumazenil, 24 saat boyunca uygulanmış ve bir grup hücreye DMSO (dimetil sülfoksit) uygulanmıştır. Tüm örneklerden sırasıyla yapılan total RNA izolasyonu ve cDNA sentezinin ardından elde eldilen genomik materyal ile kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) gerçekleştirilmiş ve hücrelere ait Gabra3 ifadesi ve değişimleri karşılaştırılmıştır. In vitro deneylerin sonucunda; MDA-MB-436 hücrelerinin Gabra3 ifadesinin MCF-7 hücrelerinin Gabra3 ifadesine göre 20 kat fazla olduğu görülmüştür. Flumazenil uygulamasının tüm konsantrasyonlarında ise MDA-MB-436 hücrelerinin Gabra3 ekspresyonunun arttığı belirlenmiştir. Yapılan 0,01 μM ve 1 μM flumazenil uygulaması Gabra3 ifadesini MDA-MB-436 kontrol hücrelerine göre sırasıyla 8 ve 10 kat arttırırken, yüksek konsantrasyondaki 10 μM ve 100 μM flumazenil uygulaması ise kontrole kıyasla Gabra3 geninin ifadesini sırasıyla 0,5 ve 1 kat oranında arttırmıştır. Flumazenilin Gabra3 üzerindeki etkisine bağlı olarak meme kanserinde kullanımının daha ileri çalışmalarla belirlenmesi gerekmektedir.
İlaç yeniden konumlandırmanın in silico ve in vitro uygulaması
Meme kanseri dünya çapında kadınlar arasında en sık rastlanan kanser türüdür. Yapılan son kanser istatistiklerine göre; meme kanseri 2017 yılında kadınlarda tanısı koyulan kanserlerin %30'unu oluşturarak, en yüksek görülme sıklığına sahiptir. Bu hastalık, nüfus üzerindeki büyük etkisi nedeniyle, kritik bir sağlık sorununu temsil etmekte ve erken tanı ve tedavisi için moleküler seviyede daha fazla araştırma yapılmasını gerektirmektedir. Meme kanseri hastalarının sağ kalım oranını etkileyen en önemli faktörlerden biri metastazdır. Yakın zamanda yayınlanan bir makale ile normal şartlarda sadece beyinde ifade edildiği düşünülen GABAA reseptör alfa3 (Gabra3)'ün meme kanseri hücrelerinin metastazında kritik bir rol aldığı kanıtlanmıştır. Ayrıca Gabra3'ün normal meme epitelyal hücrelerinde ifade edilmediği yapılan birçok çalışma sayesinde bilinmektedir. Bu tez çalışmasında; MCF-7 ve MDA-MB-436 kanser hücre hatlarındaki Gabra3 ifadesinin incelenmesi ve bir GABA antagonisti olan flumazenil molekülünün MDA-MB-436 meme kanseri hücrelerine karşı etkisinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Bu amaç doğrultusunda, Gabra3/Gabrg2 dimeri modellenmiş ve bilgimiz dahilinde, literatürde ilk kez flumazenil ve Gabra3/Gabrg2 dimerinin moleküler kenetlenme çalışması yapılmıştır. Gabra3/Gabrg2 dimerinin moleküler kenetlenme analizlerinde uygulanan bütün programlar için altyapı olarak Maestro Molecular Modeling Interface 11.3 (Schrödinger Release 2017-3: Maestro, Schrödinger, LLC, New York, NY, 2017) kullanılmıştır. Yapılan SP (Standart precision) ve XP (Extra precision) Glide moleküler kenetlenme çalışmaları sonucunda flumazenilin Gabra3/Gabrg2 dimerine XP metotunda -6.229, SP metotu ile ise -7.167 skoru ile bağlandığı belirlenmiştir. Ardından bu bağlanmanın in vitro etkisini gözlemlemek için MCF-7 ve MDA-MB-436 hücrelerinin kültürü yapılmıştır. MDA-MB-436 hücrelerine 0,01 µM, 1 µM, 10 µM ve 100 µM kosantrasyonlarındaki flumazenil, 24 saat boyunca uygulanmış ve bir grup hücreye DMSO (dimetil sülfoksit) uygulanmıştır. Tüm örneklerden sırasıyla yapılan total RNA izolasyonu ve cDNA sentezinin ardından elde eldilen genomik materyal ile kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) gerçekleştirilmiş ve hücrelere ait Gabra3 ifadesi ve değişimleri karşılaştırılmıştır. In vitro deneylerin sonucunda; MDA-MB-436 hücrelerinin Gabra3 ifadesinin MCF-7 hücrelerinin Gabra3 ifadesine göre 20 kat fazla olduğu görülmüştür. Flumazenil uygulamasının tüm konsantrasyonlarında ise MDA-MB-436 hücrelerinin Gabra3 ekspresyonunun arttığı belirlenmiştir. Yapılan 0,01 μM ve 1 μM flumazenil uygulaması Gabra3 ifadesini MDA-MB-436 kontrol hücrelerine göre sırasıyla 8 ve 10 kat arttırırken, yüksek konsantrasyondaki 10 μM ve 100 μM flumazenil uygulaması ise kontrole kıyasla Gabra3 geninin ifadesini sırasıyla 0,5 ve 1 kat oranında arttırmıştır. Flumazenilin Gabra3 üzerindeki etkisine bağlı olarak meme kanserinde kullanımının daha ileri çalışmalarla belirlenmesi gerekmektedir.
İlaç yeniden konumlandırmanın in silico ve in vitro uygulaması
Meme kanseri dünya çapında kadınlar arasında en sık rastlanan kanser türüdür. Yapılan son kanser istatistiklerine göre; meme kanseri 2017 yılında kadınlarda tanısı koyulan kanserlerin %30'unu oluşturarak, en yüksek görülme sıklığına sahiptir. Bu hastalık, nüfus üzerindeki büyük etkisi nedeniyle, kritik bir sağlık sorununu temsil etmekte ve erken tanı ve tedavisi için moleküler seviyede daha fazla araştırma yapılmasını gerektirmektedir. Meme kanseri hastalarının sağ kalım oranını etkileyen en önemli faktörlerden biri metastazdır. Yakın zamanda yayınlanan bir makale ile normal şartlarda sadece beyinde ifade edildiği düşünülen GABAA reseptör alfa3 (Gabra3)'ün meme kanseri hücrelerinin metastazında kritik bir rol aldığı kanıtlanmıştır. Ayrıca Gabra3'ün normal meme epitelyal hücrelerinde ifade edilmediği yapılan birçok çalışma sayesinde bilinmektedir. Bu tez çalışmasında; MCF-7 ve MDA-MB-436 kanser hücre hatlarındaki Gabra3 ifadesinin incelenmesi ve bir GABA antagonisti olan flumazenil molekülünün MDA-MB-436 meme kanseri hücrelerine karşı etkisinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Bu amaç doğrultusunda, Gabra3/Gabrg2 dimeri modellenmiş ve bilgimiz dahilinde, literatürde ilk kez flumazenil ve Gabra3/Gabrg2 dimerinin moleküler kenetlenme çalışması yapılmıştır. Gabra3/Gabrg2 dimerinin moleküler kenetlenme analizlerinde uygulanan bütün programlar için altyapı olarak Maestro Molecular Modeling Interface 11.3 (Schrödinger Release 2017-3: Maestro, Schrödinger, LLC, New York, NY, 2017) kullanılmıştır. Yapılan SP (Standart precision) ve XP (Extra precision) Glide moleküler kenetlenme çalışmaları sonucunda flumazenilin Gabra3/Gabrg2 dimerine XP metotunda -6.229, SP metotu ile ise -7.167 skoru ile bağlandığı belirlenmiştir. Ardından bu bağlanmanın in vitro etkisini gözlemlemek için MCF-7 ve MDA-MB-436 hücrelerinin kültürü yapılmıştır. MDA-MB-436 hücrelerine 0,01 µM, 1 µM, 10 µM ve 100 µM kosantrasyonlarındaki flumazenil, 24 saat boyunca uygulanmış ve bir grup hücreye DMSO (dimetil sülfoksit) uygulanmıştır. Tüm örneklerden sırasıyla yapılan total RNA izolasyonu ve cDNA sentezinin ardından elde eldilen genomik materyal ile kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) gerçekleştirilmiş ve hücrelere ait Gabra3 ifadesi ve değişimleri karşılaştırılmıştır. In vitro deneylerin sonucunda; MDA-MB-436 hücrelerinin Gabra3 ifadesinin MCF-7 hücrelerinin Gabra3 ifadesine göre 20 kat fazla olduğu görülmüştür. Flumazenil uygulamasının tüm konsantrasyonlarında ise MDA-MB-436 hücrelerinin Gabra3 ekspresyonunun arttığı belirlenmiştir. Yapılan 0,01 μM ve 1 μM flumazenil uygulaması Gabra3 ifadesini MDA-MB-436 kontrol hücrelerine göre sırasıyla 8 ve 10 kat arttırırken, yüksek konsantrasyondaki 10 μM ve 100 μM flumazenil uygulaması ise kontrole kıyasla Gabra3 geninin ifadesini sırasıyla 0,5 ve 1 kat oranında arttırmıştır. Flumazenilin Gabra3 üzerindeki etkisine bağlı olarak meme kanserinde kullanımının daha ileri çalışmalarla belirlenmesi gerekmektedir.