İnsan lökosit myeloperoksidazının saflaştırılması

Myeloperoksidaz (MPO), (oksidoraductaz, EC 1.11.1.7) memeli nötrofillerinin granüllerinde yer alan bir enzim olup, fagosite edilmiş bakterilerin öldürülmesinde önemli rol oynamaktadır.Buffy coattan ficoll gradiyeniti ile, EDTA'lı antikoagülanli kandan, sitratlı antikoagülanlı at kanından lökosit elde edilerek, buffy coattan CaCl2 kullanarak lökositleri yıkamasıyla, native fare 32DcI3 hücrelerinden ve lökoferez sonrası lökositlerden myeloperoksidaz (MPO) enzimi izole edilmiştir.Bu çalışmada insan myeloperoksidaz enzimini (MPO), lökosit solübilizasyonu, Con A Sepharose 4B affinite jel kromotografisi, amonyum sülfat çöktürmesi, Sephacryl S300 HR jel kromotografisi ve CM Sefhadex G 25 İyon Değiştirici kromotografi aşamaları ile saflaştırılmıştır. Bu yöntem ile H2O2 substratı kullanılarak insan myeloperoksidaz enzimi 71,45 kez saflaştırılmış ve spesifik aktivitesi 1192,574 u/mg protein olarak bulunmuştur. Sodyum Dodesil Sülfat Poliakrilamid Jel Elektroforezi ile saflık derecesi kontrol edilmiş. Saflaştırılmış enzimin Michaelis-Menten ve Lineweaver-Burk grafikleri çizilerek 37 oC'de 50mM KPO4 , %0,5 CETAB tamponunda (pH: 5,4) H2O2 substratı için Km değeri 0,369 µmol ve Vm değeri 1,077 µmol/dk/mg protein olarak saptanmıştır.