Kemoterapi ajanı Doksorubisin'in Escherichia coli üzerindeki etkisi ve dirençle ilgili genlerin genom boyu kütüphane zenginleştirme ve tarama çalışmaları ile araştırılması

Kanser hastalıklarının tedavisinde kullanılan kemoterapik ilaçlara karşı, kanser hücreleri zaman zaman direnç gösterebilmektedir. Kanser hücresi, bazı genlerin yapısını ve ifadesini değiştirerek ilaçtan kaçabilmekte ve kanserin nüksetmesi ile ölümcül sonuçlar görülebilmektedir. Direncin moleküler mekanizmasında görevli olabilecek genler ve proteinlerin tespiti, hem temel bilimler açısından, hem de tedavi açılımları sunması bakımından önemlidir. Doksorubisin, kanser tedavisinde rutin olarak kullanılan, aynı zamanda da antibakteriyel etkiye sahip, yaygın bir kemoterapik ajandır. Bu ilaç bir hücreye verildiği zaman, DNA'ya hasar vermekte ve hücrenin ölümüne neden olmaktadır. Ancak, bu ilaca karşı da kanser hücresinin direnç geliştirebildiğine dair raporlar mevcuttur. İlacın hem moleküler hedeflerinin bulunması, hem de direnç gelişiminde doğrudan veya dolaylı olarak rolü olan genlerin tespit edilmesi farklı hücresel sistemlerde araştırılmalıdır. Bu tez çalışmasının amacı, bakteri hücresini model olarak kullanarak, artan doksorubisin konsantrasyonlarında, 4123 genin taranarak, hücreye direnç kazandıran gen adaylarının araştırılmasıdır. Burada, Escherichia coli genlerinin bir ekspresyon plazmidine klonlanması ile elde edilen ASKA klon seti kullanılmıştır. 57 adet mikroplakadan oluşan bu set, 4123 adet gen ile ilaç ilişkisini farklı açıdan irdelememizi sağlayan eşsiz bir genomik kaynaktır. Her bir genin ifadesi IPTG ile indüklenebildiği için, genler taranabilmekte ve yabanıl tipin öldüğü ilaç konsantrasyonunda yaşayan klonun içerdiği gen, direnç fenomeni ile doğrudan veya dolaylı olarak ilişkili olduğu yaklaşımı esas alınmaktadır. Bu çalışmada, ilk olarak, birkaç farklı E. coli yabanıl tip bakteri suşları ile yapılan ön deneylerde, doksorubisinin hangi E. coli suşunu, hangi konsantrasyonda öldürdüğü, minimum inhibe edici konsantrasyon (MIC) deneyleri, büyüme eğrisi deneyleri, spot testleri ve disk difüzyon yöntemleri ile belirlenmiştir. Daha sonra, 4123 adet klonun "genom boyu plazmid kütüphanesi" stokları kullanılarak, ısı şoku yöntemi ile E. coli D10Hb suşuna transforme edilmiştir. Optimizasyon deneylerinden elde edilen konsantrasyon verileri kullanılarak, göreceli olarak yüksek doksorubisin içeren ortamlarda yaşayabilen klonların tespit edilmesi amacıyla, gradient ekim, direkt ekim ve zenginleştirme ile seleksiyon deneyleri gerçekleştirilmiştir. Doksorubisin toleransına sahip, 129 adet koloni ile onaylama çalışmaları yapılmıştır. Daha sonra göreceli olarak en yüksek tolerans değerine sahip 34 koloni seçilmiştir. Seçilen rekombinant plazmidlerin içerdikleri gen dizileri, sanger sekanslama analizi ile belirlenmiştir. Elde edilen sekanslar kullanılarak, Blast analizleri ile gen bilgileri bulunmuştur. Çalışmalar sonucunda, göreceli olarak yüksek doksorubisin konsantrasyonlarında yaşayan E. coli klonlarının plazmidlerinde yer alan genlerin recA (n=23 klon) ve mdtK (n=11 klon) olduğu tespit edilmiştir. Bu genlerin DNA hasarı onarımında ve Na+ kanallarını kullanarak ilacı hücrenin dışına atabilmede görevli olabileceği tartışılmıştır. Ayrıca bu genlerin insan genomunda homologları araştırılmıştır. Bu çalışma, binlerce genin (n=4123) bir ilaçla ilişkisini tarayan ve bakteriyel model hücre yaklaşımı ile kanser konusuna farklı bir açıdan yaklaşan, moleküler biyoloji, mikrobiyoloji ve genomik disiplinlerini kullanan, kapsamlı, orijinal ve yol gösterici sonuçlar veren bir tez çalışmasıdır. Anahtar Kelimeler: Direnç, doksorubisin, Escherichia coli, gen, genomik, mdtK, recA