Krisinin immunmodulatör etki yoluyla meme kanseri hücreleri üzerine olan anti-tümör etkisinin araştırılması

Krisin (5,7-dihidroksiflavon), doğal olarak bitki ve arı ürünlerinde bulunan bir flavonoiddir ve önemli biyolojik aktiviteleriyle, özellikle de anti-kanser etkileriyle bilinir. Faydalı özellikleri kısmen bağışıklık hücrelerini aktive etme yeteneğine atfedilmiştir. Bu çalışmanın ilk amacı; krisinin doğal öldürücü (NK) NK-92 hücreleri, Jurkat T hücreleri ve RAW 264.7 makrofaj hücrelerinin aktivitelerini ve bu hücrelerin MCF-7 ve MDA-MB-231 gibi iki farklı tipte meme kanseri hücre hattına karşı olan anti-tümöral potansiyellerini nasıl değiştirdiğini araştırmaktır. İkinci olarak krisin etken maddesinin MCF-7 ve MDA-MB-231 meme kanseri hücrelerindeki immün kaçış mekanizmalarında önemli rol oynayan programlı hücre ölümü ligand-1 (PD-L1) protein ekspresyonuna ve yine kanser hücrelerinin hayatta kalım proteinlerinden olan p-akt ve p-mTOR protein ekspresyonları üzerindeki etkilerini değerlendirmektir. İlk olarak, krisinin meme kanseri ve normal meme hücre hatlarındaki anti-proliferatif etkisi, reaktif oksijen türleri (ROS) üretim aktivitesi ve apoptotik etkisi sırasıyla MTT testi, DCF-DA floresan probu kullanılarak immünofloresan (IF) boyama ve akış sitometri testi, ve akridin oranj ve etidyum bromür (AO/EB) çift boyaması ile Annexin V/PI boyaması kullanılarak IF boyaması ve akış sitometri analizleri ile ölçüldü. NK-92, Jurkat T hücreleri ve RAW 264.7 makrofaj hücrelerinin proliferasyonları WST-1 testi ile analiz edildi. NK-92 hücrelerinin etkinliği, IL-2 varlığında akış sitometri ile CD56+ yüzey protein ekspresyonunun analizi ve IFN-γ üretiminin enzim bağlı immünosorbent test (ELISA) ile spektrofotmetrik olarak ölçülmesiyle değerlendirildi. PHA-M ile indüklenen Jurkat T hücrelerinin aktivitesindeki değişiklik, ELISA yöntemiyle belirlendi. Makrofaj hücre hattında ise TNF-α ve nitrik oksit (NO) düzeylerinin ELISA ve Griess reaktifi ile ölçülmesiyle aktivasyon analizleri yapıldı. Krisin uygulanan NK-92 hücreleri doğrudan meme kanseri hücreleri ile birlikte kültüre edildi; meme kanseri hücrelerinin canlılığı MTT testi ile ölçüldü, süpernatantlardaki sitokinler ve granzim-B miktarları ELISA ile, NO miktarı ise Griess reaktifi ile ölçüldü. Krisine maruz bırakılmış meme kanseri hücreleri, PHA-M ile stimüle edilen Jurkat T hücreleri ile doğrudan ko-kültüre edildi; süpernatantlardaki sitokin düzeyleri ELISA testi ile belirlendi. Krisin uygulanan makrofaj hücrelerinin büyüme ortamları ile meme kanseri hücre süpernatantları birlikte kültüre edildi; meme kanseri hücrelerindeki apoptoz düzeyi AO/EB çift boyaması ve Aleksa-fluor-488 bağlı kaspaz-3 ölçümü IF yöntem ile gösterildi. PD-L1 protein düzeyleri EGF ile indüklenen meme kanseri hücrelerinde IF boyama ve western-blot yöntemleri ile analiz edildi. Yine meme kanseri hücrelerindeki p-akt ve p-mTOR protein ekspresyonları western-blot yöntemi ile değerlendirildi. Krisin, MCF-7 ve MDA-MB-231 hücrelerinde artan intraselüler ROS üretimi ile sitotoksik ve apoptotik aktivite gösterdi. Ayrıca, NK-92 ve T hücrelerinin her iki meme kanseri hücre hattına karşı sitotoksisitesini önemli ölçüde artırdı ve en belirgin etki MCF-7 hücrelerinde (%20) gözlendi. Bu sitotoksik etki IL-2 ve PHA-M varlığında daha da artarken, epidermal büyüme faktörü (EGF) ile tedavi edilen meme kanseri hücrelerinde azaldı. NK-92 hücrelerinin meme kanseri hücre hatlarına karşı anti-tümöral yanıtı, granzim-B, TNF-α ve NO üretimindeki artışla ilişkili bulundu. Benzer şekilde, Jurkat T hücrelerinin meme kanseri hücre hatlarına karşı aktivasyonu, granzime-B, IL-2 ve IFN-γ üretimindeki artışla karakterize edildi. Makrofaj hücrelerinin anti-kanser yanıtı ise, meme kanseri hücrelerinde artan apoptoz ile ilişkilendirildi. Ayrıca, NK-92 hücrelerinin krisin ile uyarılması artmış IFN-γ üretimi ve CD56 ekspresyonu ile, Jurkat T hücrelerinin uyarılması IL-2 üretimi ile, RAW 264.7 makrofaj hücrelerinin uyarılması ise NO üretiminin artışıyla karakterize edildi. İki farklı meme kanseri hücre hattında EGF ile artan PD-L1 ve p-akt protein düzeyleri krisin ile inhibe olurken, p-mTOR protein ekspresyonunda anlamlı ir artış gözlenmedi. Bulgular, krisinin iki farklı meme kanseri hücre hattına karşı NK-92, T ve makrofaj hücrelerinin aktivasyonuna ve fonksiyonel artışına önemli ölçüde katkıda bulunduğunu, immün yanıttan kaçış mekanizmasında öneme sahip olan PD-L1 proteinini ve kanser progresyonunda rol oynayan p-akt düzeylerini azaltarak kanser tedavisinde hem terapötik hem de kanserin ilerlemesini önlemede kemo-preventif bir ajan olarak kullanılma potansiyelini desteklemektedir. Anahtar Kelimeler: Krisin, NK hücresi, T hücresi, Makrofaj, Meme Kanseri, İmmün Kontrol Noktası Proteinleri