Kırım Kongo Kanamalı Ateş virüsü kelkit suşu proteinlerinin ökaryotik hücrelerde stabil ifadesi

Kırım Kongo Kanamalı Ateşi (KKKA), insanlarda ciddi hastalığa neden olan zoonotik bir bulaşıcı hastalıktır. Bu hastalık özellikle vektör kenelerin endemik olduğu ülkelerde yüksek ölüm oranı ile karakterizedir. KKKAV'nün biyolojisi ve immunolojisine yönelik çalışmalarda viral proteinler diğer viral sistemde olduğu gibi büyük öneme sahiptir. KKKAV proteinlerinin çeşitli süreçlerdeki önemi birçok araştırmalarda ele alınmış ve bu çalışmalarda KKKAV proteinleri genellikle geçici ifade sistemleri kullanılarak üretimi sağlanmıştır. Bununla birlikte, proteinlerin stabil ifadesi tüm çalışmalar için zaman içerisinde tutarlı ve güvenilir bir model olmaktadır. Bu yüksek lisans tez çalışmasında, insan hücrelerindeki glikozilasyon süreçlerini taklit edebilen ökaryotik hücre hatları kullanarak KKKAV glikoproteinlerinin ve nükleoproteinlerinin stabil ekspresyon ile sürekli bir şekilde üretilmesini amaçlanmıştır. Bunun için insan hepatoselüler hücre hatları (Huh-7), KKKAV proteinlerinin stabil ifadesinde kullanılmıştır. Hücrelerde seleksiyon için seçici antibiyotiklere olan dirençleri, MTT analizi ile değerlendirilmiştir. KKKAV NP, PreGn ve PreGc kodlayan plazmitler Lipofectamine® 3000 ve polietilenimine (PEI) gibi transfeksiyon ajanlarının yardımıyla hücrelere aktarılmıştır. KKKAV nükleoproteinlerini ve glikoproteinlerini kararlı bir şekilde ifade eden hücreler, antibiyotiklere dirençli olan kolonilerin seleksiyonu ile üretilmiştir. Hücrelerde transfekte edilen genin stabil ekspresyon için genoma entegrasyonunun tespiti, transfekte edilen KKKAV genlerine özgü primerler tasarlanarak polimeraz zincir reaksiyonu ile gerçekleştirilmiştir. Genomik düzeydeki doğrulamaların yanı sıra hücrelerdeki hedef proteinlerin ifadesi gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu, Western blot, enzim immünoanalizleri ve immunfloresan analizleri ile de test edilmiştir. Yapılan deneyler, KKKAV proteinlerinin stabil hücrelerde başarılı bir şekilde ifade edildiğini göstermiştir. Western blot analizi, stabil hücre hatlarında üretilen proteinlerin beklenen boyutta olduğunu ve antijenitelerini doğrularken, EIA analizi bunların antijenik özellikleri tekrar test edilmiştir. Ayrıca, immunofloresan yöntemle mikroskobik görüntüleme üretilen proteinlerin hücreler içindeki lokalizasyonunu ortaya koymuştur. Özetle, bu tez çalışmasında, stabil hücrelerde KKKAV'nün nükleoprotein ve glikoproteinleri başarılı bir şekilde üretilmiştir. Bu stabil hücre hatlarının, KKKAV 'nün biyolojisi, immunolojisi ve patojenezi üzerine daha detaylı araştırmalarda önemli araçlar olarak hizmet etmesi beklenmektedir; çünkü bu virüs, araştırılması gereken öncelikli patojenlerden biri olarak kabul edilmektedir.