Immobilization of lipase enzyme onto precipitated silica and synthesis of polycaprolactone

Polikaprolakton (PKL), alifatik polyersterler sınıfından olan sentetik bir polimerdir ve sentetik özellikte olmasına rağmen biyouyumluluk ve geçirgenlik gibi özellikleri sayesinde biyomedikal uygulamalar başta olmak üzere oldukça geniş bir uygulama alanına sahiptir. PKL sentezi için genel olarak kalay karboksilatlar ve alüminyum alkoksitler gibi organometalik katalizörler kullanılmaktadır; ancak sentez sonrasında bu katalizörlerin kalıntılarını ortamdan tamamen ayırmak mümkün değildir. Bu kalıntılar zehirli içerikleri nedeniyle, özellikle biyomedikal uygulamalarda tolere edilemeyecek miktardadırlar. Son yıllarda, metal katalizörler yerine lipazlar gibi birçok biyokatalizör PKL sentezi için kullanılmaya başlanmıştır. Lipaz katalizörlüğünde gerçekleştirilen enzimatik polimerizasyon reaksiyonları, yüksek enantio ve regioseçiçilik, enzimin tekrar tekrar kullanılabilir özellikte olması ve ılımlı reaksiyon koşulları gibi özellikleri sayesinde geleneksel kimyasal polimerizasyon reaksiyonlarına göre daha avantajlı bir seçenek haline gelmiştir. Candida antarctica lipaz B, hem serbest formda hem de immobilize formda en fazla kullanılan lipazlardan biridir. Yüksek seçicilik özelliği ile aminoliz, esterifikasyon ve transesterifikasyon gibi birçok reaksiyonu katalizleyebilme özelliğine sahiptir. Diper enzimler gibi lipazların da destek bir malzemeye immobilize edilmesi ile, serbest formdaki lipazın stabilite, tekrar kullanılabilirlik ve seçicilik gibi özellikleri geliştirilebilmektedir. Yapılan birçok çalışma, immobilize formdaki CALB'nin polimerizasyon reksiyonlarında daha etkin olduğunu göstermiştir. Bu çalışmanın ilk aşamasında; Candida antarctica lipaz B, çapraz bağlama ve fiziksel adsorpsiyon yöntemleri ile immobilize edilmiştir. İki farklı immobilizasyon tekniğinin kullanılmasıyla, daha etkin olan yöntemi belirlemek hedeflenmiştir. Daha önce yapılan çalışmalar incelenerek; silika bazlı malzemelerin CALB immobilizasyonu için daha uygun olduğu görülmüş ve bundan dolayı mezopor yapıya sahip olan çöktürülmüş silika, bu çalışmada taşıyıcı malzeme olarak seçilmiştir. Ayrıca bu çalışmada çöktürülmüş silika, ilk defa CALB immobilizasyonunda kullanılmıştır. Çalışmada 3-aminopropiltrietoksisilan ve glutaraldehit, sırasıyla silanlama ajanı ve çapraz bağlayıcı olarak kullanılmıştır. 3-APTES/aseton oranı % 5, % 10, % 15 ve % 20'ye; glutaraldehit/fosfat tampon çözeltisi oranı da % 0.02, % 0.2 ve % 2'ye ayarlanarak; optimum 3-APTES ve glutaraldehit oranları belirlenmiştir. Daha sonra CALB, silanlanmış ve çapraz bağlanmış taşıyıcı malzemeler üzerine, enzim/silika oranı 0.5, 1, 2 ve 3'e ayarlanarak immobilize edilmiştir. Böylelikle, optimum lipaz konsantrasyonu da belirlenmiştir. Lipaz aktivitesi ve protein tayini, alkalimetrik titrasyon ve ultraviyole spektrofotometre ile hesaplanmıştır. Elde edilen sonuçlara gore, fiziksel adsorpsiyon ile immobilize edilen enzimin çapraz bağlama ile immobilize edilen enzyme gore daha aktif olduğu söylenebilir. Aktivite değerleri adsorplanan ve çapraz bağlanan enzimler için sırasıyla: yaklaşık olarak 4330 ve 2830 U olarak hesaplanmıştır. Her iki immobilize enzim için de, optimum 3-APTES/aseton ve lipaz konsantrasyonu, % 15 ve 2 olarak belirlenmiştir. Kullanılan glutaraldehit miktarı arttıkça ise, enzim aktivitesinin düştüğü görülmüştür. Buna göre glutaraldehit kullanılmadan, yani fiziksel adsorpsiyon yöntemi ile yapılan immobilizasyon işlemi sonucu, daha aktif enzimler elde edilmiştir. İmmobilize edilen enzimlerin raf ömrünü belirlemek için 4 ay boyunca düzenli olarak aktivite ölçümü yapılmıştır. Elde edilen sonuçlara göre, çapraz bağlanan ve adsorplanan lipazlar sırasıyla: % 59 ve % 50.1 oranında başlangıç aktivitelerini korumuşlardır. Ek olarak, lipaz aktiviteleri 4.5, 5.5, 6.5, 7, 7.5, 8.5, 9.5 and 10.5 pH değerlerinde ve 30, 35, 37, 40, 45, 50, 55 ve 60 ºC'de ölçülmüş ve optimum pH ve sıcaklık değerleri belirlenmiştir. Fiziksel adsorpsiyon ile immobilize edilen enzim için en yüksek aktivite yaklaşık 7-8 pH değerlerinde ve 37 ºC'de elde edilirken; çapraz bağlama ile immobilize edilen lipaz için 7 pH değeri ve yaklaşık 35-37 ºC optimum değerler olarak belirlenmiştir. Bunun yanında immobilize edilen enzimlerin aktiviteleri, CALB'nin serbest ve ticari immobilize formu (Novozym® 435)'nun aktiviteleri ile de karşılaştırılmıştır. Sonuçlara gore, her iki immobilize enzimin de aktivitesi serbest CALB'den yüksek iken; sadece adsorpsiyon ile immobilize edilen enzim aktivitesi Novozym® 435'in aktivitesine yaklaşabilmiştir. Son olarak, çötürülmüş silika ve immobilize enzimler fourier dönüşümlü kızılötesi spektroskopisi, termogravimetrik analiz ve taramalı elektron mikroskobu ile karakterize edilmiştir. Çalışmanın ikinci aşamasında, immobilize edilen enzimler ɛ-kaprolaktonun (ɛ-KL) halka açılma polimerizasyonu yöntemi ile polimerize edilmesi için katalizör olarak kullanılmıştır. Reaksiyonlar 40, 60, 80 ºC sıcaklık değerleri ve 6, 24, 48, 120, 150 and 170 saatlik zaman periyotlarında gerçekleştirilmiştir. Enzim/ɛ-KL oranı % 2.5, % 5, % 10 ve % 20 olarak ayarlanarak; PKL'nin immobilize edilen enzimlerle sentezi için, optimum enzim konsantrasyonları belirlenmiştir. Sentezlenen PKL'lerin molekül ağırlıkları, jel geçirgenlik kromatografisi ve proton nükleer manyetik rezonans spektroskopisi ile belirlenmiştir. Sonuçlara göre, fiziksel adsorpsiyon ile immobilize edilen lipazın katalizörlüğünde sentezlenen PKL'ler için en yüksek molekül ağırlığı ve monomer dönüşüm oranı 14300 g/mol ve % 90 olarak hesaplanmıştır. Çapraz bağlı immobilize enzim kullanılarak sentezlenen PKL'ler için ise; en yüksek molekül ağırlığı 9000 g/mol ve % 90 olarak belirlenmiştir. Ayrıca, en yüksek molekül ağırlıkları her iki immobilize enzim için de % 20'lik enzim/ɛ-KL oranında elde edilmiştir. İmmobilize enzimlerin tekrar kullanılabilirliklerinin tayini için, her iki immobilize lipaz da seri halinde 5 defa PKL sentezi için kullanılmış ve 5. reaksiyon sonunda adsorplanan enzim yaklaşık % 32, çapraz bağlanan enzim ise yaklaşık % 42 oranında başlangıç aktivitesini korumuştur. Ek olarak, immobilize enzimlerin kullanıldığı sentez sonuçları, serbest CALB ve Novozym® 435 kullanılarak sentezlenen PKL'lerin molekül ağırlıkları ile kıyaslanmıştır. Buna göre, her iki immobilize enzim ile elde edilen sonuçlar, serbest CALB ile elde edilene oranla daha yüksek olmuştur. Ayrıca, adsorplanan CALB ile elde edilen sonuç Novozym® 435 ile elde edilene göre daha yüksek olurken; çapraz bağlı enzim bu değere % 70 oranında yaklaşabilmiştir. Son olarak, sentezlenen PKL'lerin yüzey morfolojileri taramalı elektron miksroskobu ile analiz edilmiştir. Bunun yanında, fourier dönüşümlü kızılötesi spektroskopisi, termogravimetrik analiz ve diferansiyel tarama kalorimetrisi ile katarizasyon yapılmıştır. PKL'nin karakteristik pikleri bu analizler sonucunda elde edilen diyagramlarda gösterilmiştir. Sonuç olarak bu çalışma; immobilizasyon ile, lipazın aktivite, stabilite ve tekrar kullanılabilirlik gibi birçok özelliğinin geliştiğini göstermiştir. Lipaz aktivitesi immobilizasyon sonunda beklenmedik şekilde artmış ve her iki immobilize enzim de çok ciddi bir aktivite kaybı olmadan defalarca kullanılabilmiştir. Böylelikle, lipazın endüstriyel uygulamalarda kullanımı daha ekonomik hale gelmiş ve çalışma bu yönüyle, enzimlerin kullanıldığı "çevredostu proses"lere katkı sağlamıştır. Son olarak, çalışmada enzimatik polimerizasyon yöntemi uygulanarak; polikaprolakton sentezlenmiş ve diğer polimerizasyon yöntemleriyle elde edilen sonuçlara paralel olarak yüksek molekül ağırlığı ve monomer dönüşüm oranlarına ulaşılmıştır. Bu sayede mevcut kirlilik sorunlarını ortadan kaldırmayı hedefleyen "yeşil polimer kimyası"na da katkı sağlanmıştır.