Lökosit sistin düzeyinin belirlenmesi için bir lc ms/ms metodu geliştirilmesi

Sistinozis lizozomlarda sistin birikimiyle karakterize, başta böbrek olmak üzere birçok organda geri dönüşümsüz hasara neden olan otozomal resesif kalıtılan bir hastalıktır. Sistinozisin teşhisi ve sisteaminle tedavisinin takip edilmesi için lökosit içi sistin konsantrasyonunun ölçümü gerekmektedir. Lökosit içi sistin düzeyinin belirlenmesi için sistin bağlayıcı protein assay, iyon değişim kromatografisi, HPLC ve son yıllarda ise LC MS MS yöntemi kullanılmaktadır. Lökosit içi sistin düzeyi belirlenmesi için birkaç yöntem olmasına rağmen kan toplama tüplerinin ve örnek hazırlama işlemlerinin lökosit sistin düzeyi tayinine etkisine yönelik bir çalışmaya rastlanılmamıştır. Bu tez çalışmasının birincil amacı lökosit içi sistin tayininine yönelik yeni bir LC MS MS yöntemi geliştirmek, yöntemi valide etmek ve kan alma tüpleri ve ön işlemlerin ölçüme etkisini incelemektir. İkincil amacı ise intrasellüler düzeyde çok az bulunan ve yapı olarak sistine benzeyen homosistin molekülünün internal standart olarak kullanılabilirliğinin test edilmesidir. Geliştirilen yöntemde optimizasyonlar sonucu %0,05 formik asit içeren %50/50 Asetonitril/Su çözgen sistemleri mobil faz olarak kullanılmıştır. Akış programı izokratik, akış hızı 0,2 ml/dakika, toplam ölçüm süresi ise 3 dakikadır. Protein çöktürme ajanının ölçüme etkisi duyarlılık ve matriks etkisi yönünden incelenmiştir. %12'lik sülfosalisilik asit(SSA), %12'lik trikloroasetik asit (TCA) ve asetonitrilin (ACN) protein çöktürme ajanları olarak denendiği çalışmada en duyarlı sonuçlar %12'lik TCA ile elde edilmiştir. Kan alma tüplerinin sistin ölçümüne etkisi geri-elde, matriks etkisi ve protein miktarları yönünden değerlendirilmiştir. Bu amaçla laboratuvarlarda kan almada en fazla kullanılan antikoagulanlardan Li- Heparin, K2-EDTA, Na-Sitrat içeren tüpler kullanılmıştır. Metot validasyon parametreleri kapsamında seçicilik, linearite, tayin ve kantitasyon limitleri, taşıma etkisi, tekrarlanabilirlik, geri elde, matriks etkisi, referans aralık doğrulama, lizat stabilitesi çalışmaları yapıldı. Linearite çalışmasında geliştirilen yöntem lökosit lizatında sistin için 0,078-100 M aralığında lineer olarak bulundu. Tayin limiti 0,0192 M, kantitasyon limiti ise 0,0582 M olarak bulunmuştur. Hem d6-sistinin internal standart olarak kullanıldığı yöntemde hem de homosistinin internal standart olarak kullanıldığı yöntemde gün içi ve günler arası tekrarlanabilirlik çalışmasından elde edilen %CV değerleri %15'in altındadır ve validasyon kriterlerine uygundur. d6-sistinli yöntem için geri elde %95-103 arasında iken homosistinli yöntemde bu değerler %94-106 arasındadır. 40 sağlıklı, 6 hasta ile gerçekleştirilen referans aralık doğrulama çalışmasında d6-sistinli ve homosistinli yöntemden elde edilen sonuçlar birbiriyle karşılaştırılmış, elde edilen grafiğin R2 değeri 0,9838 bulunmuştur. Lizat stabilitesi 4 ay boyunca oda sıcaklığında, +4⁰ C'de ve -20⁰C'de çalışılmıştır. Her üç sıcaklık için de lizatın 4 ay boyunca stabil olduğu belirlenmiştir