Kütle spektrometri
Bu konu başlığı altında 162 tez
Trakya Bölgesinde yetişen etno veteriner tıbbi bitkilerin esansiyel yağının hidro distilasyon yöntemiyle elde edilmesi ve kimyasal bileşiminin belirlenmesi; sarı kantaron otu Ossa sesamoideam L.) örneği
Latince adı Hypericum perforatum L. olan sarı kantaron otu dünyada en çok "St. John' wort" adıyla Türkiye'de ise "kılıç otu, binbirdelik otu, kuzu kıran, kan otu, yara otu ve mayasıl otu" gibi isimlerle bilinmektedir. Hypericum perforatum L. Türkiye'nin birçok bölgesinde yayılış göstermektedir. Sarı kantaron otu; yara ve yanıklarda, depresyon, kanser, diyabet, mide-bağırsak rahatsızlıkları, safra ve karaciğer rahatsızlıkları, mide ülseri, sarılık, dizanteri, bronşit, diyare ve boğaz hastalıklarında kullanılmaktadır. Sarı kantaron otu oldukça geniş kimyasal bileşime sahiptir. Bunlardan biri de bitkinin içerdiği uçucu yağlardır. Hastalıkların tedavisinde kullanılan bitkilerin etkinliğinin içerdiği uçucu yağlardan kaynaklandığı bilinmektedir. Ülkemizde ve dünyada Hypericum perforatum L. ile ilgili birçok çalışma yapılmıştır ancak Trakya bölgesini kapsayan kapsamlı bir çalışma bulunmamaktadır. Bu araştırma, 2021 yılının Haziran-Ağustos ayları arasında Trakya Bölgesinde (Tekirdağ, Kırklareli, Edirne, Çanakkale (Gelibolu yarımadası), İstanbul Avrupa yakası) doğal olarak yetişen Hypericum perforatum L. türünün uçucu yağının kimyasal bileşiminin belirlenmesi amacıyla yapılmıştır. Toplanan sarı kantaron bitkisi örneklerinin uçucu yağı hidrodistilasyon yöntemiyle çıkarılmıştır. Çıkan uçucu yağların bileşenleri GC-MS yöntemiyle analiz edilmiştir. Analiz edilen uçucu yağlarda 50-64 adet bileşen tespit edilmiştir. Bitkinin uçucu yağının ana bileşenlerini genel olarak seskiterpenler (ß- caryophyllene, caryophyllene oxide, ß-selinene, α-selinene, ß-farnesene, α-amorphene, Eudesma-4(14),11-dien, spathulenol), hidrokarbonlar (1-tetradecanol, 1-tridecanol, Cycloundecane, 1,1,2-trimethyl), ayrıca diterpenler (phytol), alkoller (alpha cadinol) ve yağ asitleri (Pentadecanoic acid, Palmitic acid, 9,12-Octadecadienoic acide…) oluşturmaktadır.
Bal analizlerinde GC-MS temelli metabolomik metot ve uygulamaların geliştirilmesi
Bal, dünyanın birçok ülkesinde, sahip olduğu fonksiyonel özellikleri ve besin değerleri nedeniyle enerji sağlayan bir gıda ve önemli bir ilaç olduğu kabul edilmektedir. Bal ayrıca biyolojik, fizyolojik ve farmakolojik aktiviteleriyle de bilinmektedir. Balın içeriğinde yaklaşık 200 farklı bileşen bulunmaktadır. Ana bileşeni olan şekerlerin yanı sıra; su, proteinler, organik asitler, vitaminler, mineraller, pigmentler, fenolik maddeler, çok çeşitli uçucu bileşenler ve balın hasat edilme şeklinden kaynaklanan katı partiküller içermektedir. Ancak bal metabolomuyla ilgili çok fazla araştırma bulunmamaktadır. Araştırmalar genel olarak flavanoid ve uçucu bileşikler üzerinde yoğunlaşmıştır. Bu iki gruptaki moleküller birincil metabolitlerden farklı olarak baldaki ikincil metabolitleri oluştururlar ve genellikle balın floral orijinine göre farklılık gösterirler. Bu yüzden balların sınıflandırması ve otantifikasyonu için önemli bileşiklerdir. Bu tez kapsamında Türkiye'nin farklı bölgelerinden tedarik edilmiş 11 farklı monofloral bal numunesi GC-MS temelli metabolomik yaklaşım kullanılarak incelenmiştir. Gerçekleştirilen çalışmalar sonucunda çok sayıda metabolit tanımlanmış ve monofloral bal türlerine ait metabolit profilleri çıkarılmıştır. Örneklerde maksimum sayıda metabolitin tanımlanabilmesi amacıyla metabolit ekstraksiyonu yöntemi ve türevlendirme basamakları optimize edilmiştir. Yine aynı amaçla GC-MS temelli metabolit analizleri için uygun bir metot geliştirilmiştir. Balın sahip olduğu metabolik profil önce Fiehn, Kovartz, HMDB ve MoNa (Mass Bank of North Amerıca) kütüphaneleri kullanılarak tanımlanmış, ardından biyoinformatik analizler gerçekleştirilerek monofloral bal türlerinin metabolomik profili incelenmiştir. 11 farklı monofloral bal türü içerisinde ortalama 53 adet metabolit tespit edilmiştir.
Tuzaklamalı iyon hareketliliği-kütle spektrometrisi ile monoklonal antikorların yapısal analizi
Monoklonal antikorlar (mAb), biyoteknoloji temelli ilaçların en büyük grubunu oluşturarak ilaç sektöründe önemli bir yer tutmaktadır. Bu ilaçların karmaşık kimyasal yapıları ve çeşitli bileşenlerden oluşan örnekleri nedeniyle üretim süreçleri ve analizleri oldukça zahmetlidir. Bu sebeple, mAb tabanlı ilaçların yapısal özelliklerinin eksiksiz bir şekilde analiz edilip değerlendirilmesi, bu ilaçların geliştirilmesi aşamalarında kritik bir öneme sahiptir. Bu gereksinimi karşılamak için, mAb'ların karakterizasyonunda kromatografik, spektroskopik ve spektrometrik yöntemleri bir arada içeren tamamlayıcı analiz teknikleri geliştirilmeye çalışılmaktadır. Bu analizlerde çoğunlukla kütle spektrometrisi (MS) yöntemleri tercih edilmektedir. Aynı zamanda, iyonların gaz fazındaki etkin çarpışma kesiti (CCS) değerlerine dayalı olarak ayrıştırıldığı iyon hareketliliği (IM) tekniği ile kütle spektrometrisinin birlikte kullanıldığı sistemler (IM-MS), mAb türlerinin konformasyonel analizlerinde etkili bir yöntem olarak öne çıkmaktadır. Bu tez çalışmasında, monoklonal antikor ilaçlarının konformasyonel analizlerini gerçekleştirmek amacıyla tuzaklamalı iyon hareketliliği spektrometrisi (TIMS) teknolojisine dayalı analitik yöntemler geliştirilmiştir. Bu çalışmalarda TIMS teknolojisi, sıvı kromatografisi (LC) ve kapiler elektroforez (CE) ön ayırma teknikleriyle birleştirilmiş; ayrıca, herhangi bir kolon ya da kapiler ayırma işlemi uygulanmaksızın doğrudan infüzyon yöntemi kullanılarak gaz fazında ayırmayı sağlayan TIMS teknolojisiyle mAb analiz yöntemleri geliştirilmiştir. Tez sonucunda, IM-MS analiz yöntemlerinden elde edilen lot-to-lot bevacizumab analiz verileri ile yüzey plazma rezonans (SPR) analizleri, dairesel dikroizm (CD), yük varyantları ve glikan analizlerinden elde edilen sonuçlar karşılaştırılmış, varyantların ve modifikasyonların mAb konformasyonu üzerindeki etkileri ile ilgili önemli bilgiler elde edilmiştir.
Farklı tipteki aluminyum adjuvanların monositik hücrelerde oluşturduğu etkilerin proteomiks ve metabolomiks düzeyde incelenmesi
Aşılar, doğal enfeksiyonu taklit ederek ve uzun süreli immünolojik hafıza üreterek bulaşıcı hastalıkların neden olduğu hastalıkların mortalite ve morbiditesini azaltan biyolojik bileşiklerdir. Aşılarda kullanılan antijenlerin çoğu zayıf immünolojik cevaba sebep olduklarından dolayı aşıların etkisinin gücünü ve süresini artırmak amacıyla aşı bileşenlerine adjuvanlar da eklenmektedir. Eski yıllardan beridir aluminyum tuzları adjuvan olarak en sık kullanılan maddelerdir ve özellikle monositlere olgun bir dendritik fenotipe farklılaşmaları için güçlü bir uyarım sağlamaktadırlar. Bu tez çalışmasında U-937 ve THP-1 hücre kültüründe aluminyum oksihidroksit (AH) ve aluminyum hidroksifosfat (AP) tuzlarının farklı derişimleri kullanılarak metabolomiks ve proteomiks çalışmalar yürütülmüştür. Bu amaçla gaz kromatografisi-kütle spektrometrisi (GC-MS) ile intraselülar ve ekstraselülardametabolomiks analizler ve sıvı kromatografisikuadropol uçuş zamanlı kütle spektrometresi (LC-qTOF-MS) ile proteomiks analizler gerçekleştirilmiştir. Analizler sonucunda toplamda 170 metabolit ve 403 protein tanımlanmıştır. Tek değişkenli ve çok değişkenli veri analizleri alüminyum adjuvan tuzlarına ve THP-1 ve U937 hücre kültürü tiplerine bağlı olarak değişen metabolitleri, proteinleri ve yolakların belirlenmesini sağlamıştır. Farklı derişimlerde AH ve AP tuzlarına maruz kalan hücrelerde anlamlı düzeyde değişen endojenik metabolit ve proteinlerin mevcut alüminyum adjuvanların etkisinin güçlendirilmesine ve yeni endojen adjuvanlarının geliştirilmesine öncülük edebileceği düşünülmektedir.
Momordica charantia L. ekstrelerinin içeriğinin ve melanoma kanser hücreleri üzerine etkisinin metabolomik çalışmalarla incelenmesi
Bu tez çalışmasında, yara bakımında kullanılan Momordica charantia L. (kudret narı) Sıvı Kromatografisi/Kuadrapol Uçuş Zamanlı Kütle Spektrometrisi (LC/Q-TOF MS) temeline dayanan metabolomik çalışmalarla metabolom düzeyinde incelenmiş ve de bu bitkinin B16-F10 melanom hücre hattı üzerinde in vitro etkisi LC/Q-TOF MS ile araştırılmıştır. Bu amaçla Momordica charantia L. bitkisinin olgunlaşmış meyve ve tohumunun metanol ekstraktları hazırlanmıştır. Elde edilen ekstraktlar LC/Q-TOF MS cihazı kullanılarak C18 kolon ile gradiyent elüsyon programı kullanılarak analiz edilmiştir. Elde edilen ham veriler çeşitli veri analiz yöntemleri kullanılarak incelenmiştir. Tespit edilen piklerin normalizasyonu yapılmıştır ve meyve ve tohum arasındaki fark incelenmiştir. Araştırma sonucunda meyve ve tohum arasında metabolom düzeyinde farklılık olduğu görülmüştür.Ayrıca, Momordica charantia L.'nin cilt kanserinde etkinliğini incelemek amacıyla meyve ve tohum ekstraktları B16-F10 melanom hücre hatlarına uygulanmıştır. Kontrol grubu, tohum ve meyve grupları arasındaki farkları gözlemleyebilmek için LC/Q-TOF MS cihazı kullanılarak analiz yapılmıştır. Kontrol, meyve ve tohum grupları arasında ekstraklarının hücre hatlarına inkübasyonu sonucu 48 saat ve 72 saat inkübasyonunun sonucundaki farklar ayrı olarak incelenmiştir. Sonuç olarak, meyve (hücrede) ve tohum (hücrede) ekstraktlarının metabolitlerinin hem 48 saat inkübasyon sonrası için hem de 72 saat inkübasyon sonrası için kontrole göre farklı olduğu görülmüştür. Bu bitkinin yara bakımında kullanılmak üzere umut vaad edici olduğu sonucuna varılmıştır. Anahtar kelimeler: Sıvı kromatografisi, kütle spektrometrisi, yara bakım, biyobelirteç, metabolom ve fitoterapötik
Oligonükleotit ve dna ile yeni nesil floresans maddelerin etkileşimlerinin kütle spektrometrisi ve spektroskopik yöntemlerle incelenmesi
Tez çalışmasında yeni nesil floresans maddeler olan benzimidazol temelli platin (II) ve paladyum (II) içeren metal kompleksleri ve perilen diimit türevi yapıların tek iplik oligonükleotitler, çift iplik kısa ve uzun DNA'lar ile kovalent olmayan etkileşimleri hem DNA ile etkileşime girme mekanizmaları üzerinden hem de oluşan komplekslerin spektroskopik özelliklerinden dolayı DNA görüntüleme amacıyla kullanılabilme üzerinden tartışılmıştır. Bağlama etkileşimleri hakkında kalitatif ve/veya kantitatif bilgi sağlayan çeşitli kütle spektrometrik, spektroskopik ve jel elektroforetik yöntemler kullanılmıştır. Tez çalışmasında N,N-di(n-butil)-1,6,7,12-tetra(4-hidroksifenoksi)perilen-3,4,9,10-tetrakarboksilik asit diimit (FP-3), Sakkarinato-2,6-bis(N-metil-benzimidazol-2-il)piridinpaladyum(II) (PT-5), Sakkarinato-2,6-bis(N-metil-benzimidazol-2-il)piridinplatin(II) (PT-6) yapıları boyalar olarak kullanılmıştır. Tezde kullanılan boyaların, tek iplik oligonükleotitlerin, çift iplik DNA'ların ve aptamerlerin karakterizasyonu, bu boyalarla nükleik asitlerin etkileşimleri, etkileşim stokiyometrileri, kararlılıkları ve etkileşim oluşumunda etkili olan kovalent olmayan etkileşimin türünün tayini, DNA bağlanma yüzdeleri, inkübasyon süresinin ve inkübasyon derişiminin etkileşim üzerine etkisi ile ilgili çalışmalar Matriks Yardımlı Laser Desorpsiyon/İyonlaştırmalı Kütle Spektrometresi (MALDI-MS) ve/veya Elektrosprey İyonlaştırmalı Kütle Spektrometresi (ESI-MS) ile incelenmiştir. Aynı molekül kütlesine sahip farklı dizilimdeki oligonükleotitlerin konformasyonel olarak farklılıklarının ve bu oligonükleotitlerin eşleşmesi ile oluşan çift iplik DNA ile PT-5 ve PT-6 yapılarının etkileşimlerinin konformasyonel olarak incelenmesi amacıyla İyon Hareketliliği Kütle Spektrometresi (IM-MS) ile analizleri yapılmıştır. Bağlanmanın uygun olduğu etkileşimlerin absorbans değişiklikleri Ultraviyole-Görünür Bölge Spektroskopisi (UV-vis) ile izlenerek bağlanma sabitleri hesaplanmış ve floresans verimleri Floresans Spektroskopisi ile izlenmiş olup küçük molekül-DNA etkileşim mekanizmaları araştırılmıştır. Ayrıca tez çalışmasında kullanılmak üzere sentezlenen yapıların Agaroz Jel Elektroforezi yönteminde sensör-boyar madde olarak kullanımı ve DNA teşhisinde kullanılıp kullanılamayacağı incelenmiştir. Böylece DNA, RNA ve bunların fraksiyonlarının gözlemlenmesine dayanan, literatürde ve uygulamalarda sıklıkla kullanılan, oldukça kanserojen olan Etidyum Bromür yerine alternatif görüntüleme ajanları tespit edilmeye çalışılmıştır. Özgün 1:1 stokiyometrideki tüm etkileşimler için optimum inkübasyon süresi 24 saat olarak bulunmuştur. Perilen diimit türevi FP-3 boyasının uzun zincirli çift sarmal DNA yapıları için iyi bir interkalatör olduğu ve etkin bir şekilde görüntüleme ajanı olarak EtBr'ye alternatif olabileceği sonucuna varılmıştır. Benzimidazol türevi olan platin (II) içeren PT-6 ve paladyum (II) içeren PT-5 yapılarının DNA nükleik asitlerinin tüm nükleobazlarıyla etkileşime girdiği ve platinin paladyuma kıyasla daha kuvvetli ve kararlı etkileşim oluşturduğu belirlenmiştir. Bu boyaların DNA ile bağlanmalarında, EtBr molekülüne kıyasla daha zayıf floresans etki gösterdikleri bulunmuştur ancak özellikle uzun çift sarmal DNA'larla etkileşimler için EtBr'ye alternatif görüntüleme ajanı olabilecekleri belirlenmiştir. Tez çalışmaları sonucunda DNA ile iyi etkileştikleri tespit edilen bu boyaların tıp alanında kanser teşhisi ve ileriki deneysel çalışmalarla birlikte kanser tedavisi alanında, yan etkileri ve direnci bilinen cis-platine alternatif olarak kullanılabilme olasılıklarının yüksek olduğu kanaatine varılmıştır.
Siklodekstrin nanopartiküllerinin HEPG-2 karaciğer kanseri hücre hattı üzerine etkisinin proteomik çalışmalarla incelenmesi
Proteom; protein ve genom sözcüklerinin birleştirilmesinden türetilmiş, belli bir genom tarafından kodlanan proteinlerin tümünü işaret kapsayan bir sözcüktür. Proteom analizine proteomik denilmektedir. Bir organizma vücudunun farklı bölgelerinde, hücre döngüsünün farklı evrelerinde ve farklı çevre koşullarında farklı protein ekspresyonlarına sahiptir. Sabit bir yapı olan ve bir organizma için çok iyi tanımlanabilen genomun aksine, proteom, hücreden hücreye farklılık gösterir ve iç ve dış uyaranlara yanıt olarak biyokimyasal etkileşimler aracılığı ile sürekli bir değişim halindedir. Amfifilik siklodekstrinler kendi kendine nanopartikül oluşturabilme yeteneğine sahip moleküllerdir. Ayrıca; bu moleküllerin intrinsik olarak bazı kanser hücre hatları üzerinde apoptotik etki gösterdiği saptanmıştır. Göstermiş olduğu özellikler nedeniyle bu yapılar nano ölçekte ilaç taşıyıcı sistem olarak literatüre girmiştir. Bu tez çalışmasında, PBO kodlu amfifilik siklodekstrin nanopartikülün HEPG-2 karaciğer kanser hücreleri üzerindeki antikanser mekanizması karşılaştırmalı proteomik yaklaşımlarla tespit edilmiştir. Amfifilik siklodekstrin nanopartiküllerin etkisiyle çoğalmanın önlendiği kanser hücre hatları, işlem görmüş hücre hatları olarak kullanılmış ve T grubu olarak isimlendirilmiş olup; hiçbir şekilde işlem görmeden çoğalmanın önlenmediği grup ise kontrol grubu olarak kullanılmış olup C grubu olarak ifade edilmiştir. T ve C gruplarından elde edilmiş lizat çözeltisinden sitozolik fraksiyonlar elde edilmiştir. Proteomik çalışmalarda, 2 boyutlu jel elektroforez (2D jel elektroforez) ile ayrılan T ve C gruplarına ait proteinler için imaj analizi çalışmaları yapılmıştır. T ve C grupları için farklılaştığı tespit edilen proteinler Matriks Yardımlı Lazer İyonizasyon Kütle Spektrometrisi (MALDI-TOF/TOF-MS) ile analiz edilmiş ve tanımlanmıştır. Bu çalışma ile ilaç taşıyıcı sistem olarak kullanılan amfifilik siklodekstrin nanopartiküllerin tek başına da karaciğer kanseri üzerine etkili olduğu proteom düzeyindeki değişimlerle gösterilmiştir. Kanser tedavisinde amfifilik siklodekstrin nanopartiküllerin ilaç taşıyıcı sistem olarak kullanıldığı durumlarda, nanopartikülün kendisinin de hücre çoğalmasını baskılamada göstermiş olduğu etki göz ardı edilmemelidir sonucuna varılmıştır.
Kronik böbrek hastalarında plazma amino asit profilinin incelenmesi
Böbrek yetmezliği, artan insidansı ve prevalansı, yüksek maliyetleri ve kötü sonuçları ile dünya çapında bir halk sağlığı sorunudur. Hastalık ve yönetim, glomerüler filtrasyon hızı (GFR) ve albüminüri ile değerlendirilen, hastalık şiddetinin aşamalarına ve klinik tanıya göre sınıflandırılması yapılır. Kronik böbrek hastalığı, rutin laboratuvar testleriyle saptanabilen bir hastalıktır ve bazı tedaviler, ilerlemesini önleyebilir ve hastalığın ilerlemesini yavaşlatabilir. Bu nedenle hastalığın tanısı ve tedavisinin takibi için yeni biyobelirteçlerin keşfedilmesi önemlidir . Bu çalışmanın amacı; Kronik böbrek hastalığı olan hastalarda hem diyaliz öncesi hem diyaliz sonrası plazma serbest aminoasit profillerini incelemek ve sağlıklı kontrol grubuyla kıyaslayarak tanı ve tedavide kullanım potansiyelini araştırmaktır. Çalışmamızda Şanlıurfa Harran Üniversitesi Tıp Fakültesi Diyaliz Bölümüne başvuran KBY teşhisi konulan 46 sağlıklı ve 46 KBY tanısı konulan hastadan plazma örnekleri alındı. Plazma serbest aminoasit profilleri LC-MS/MS yöntemiyle incelendi. Elde edilen verilerin istatistik analizi SPSS ile yapıldı. İstatiksel analiz sonucunda kronik böbrek yetmezliği olan hastalarda ortalama alanin,arginin,aspartik asit, sitrulin,histidin, metionin,tirozin ve hidroksiprolin glisin,löysin,isolöysin,lizin,ornitin,fenilalanin, prolin, serin glutamikasit, glutamin valin,taurin alloizölöysin,alfaminoadipik asit,anserin,gamaaminobütirik asit,1-metilhistidin, 3- metilhistidin 5-oh-trp amino asit düzeyleri kontrol grubundan daha yüksek bulunmuştur. Fosfoetanolamin ,sistin, alfaaminobütirik asit, betaaminobütirik asit ve triptofan amino asitleri KBY hastalarında kontrol grubuna göre daha düşük bulunmuştur. Diyaliz sonrasında diyaliz öncesine göre sitrülin ,histidin ,alanin,arginin aspartik asit, glutamik asit ,glisin, sistin ,isölöysin, prolin , fosfoetanolamin ,taurin alloisolöysin, alfaaminoadipik asit ,anserin, alfaaminobütirik asit ,betaaminobütirik asit betaalanin, 1 -metilhistidin ,5-oh-trp düzeyinde artış görülürken ,glutamin löysin,lizin, ornitin fenilalanin ,serin ,valin, asparajin ,metiyonin, triptofan ,tirozin ve hidroksiprolin gamaaminobütirik asit 3-metilhistidin düzeyinde düzeyinde azalış görülmüştür. Grupların aritmetik ortalamaları arasındaki farkın anlamlılığını sınamak amacıyla kullanılan Paired samples T testinde sitrülin,glisin,lizin, anserin, alfaaminobütirik asit,gamaamino bütirik asit, fosfoetanolamin ve taurin düzeyi anlamlı bulunmuştur (p<0,05). Çalışma sonucunda KBY de aminoasitlerin rolünün anlaşılması amacıyla daha fazla çalışmaya ihtiyaç görülmüştür.
Spina bifida hastalarında aminoasit metabolizmasının incelenmesi
Spina bifida, insanlarda en sık görülen ve en karmaşık merkezi sinir sistemi malformasyonudur. Dünyada spina bifida insidansı hala 1000 doğumda 0,3-4,5 olarak görülmektedir. Normal bir gebelik oranında, orta hatta bir defektli bir bebek doğurma olasılığı 1/1000'dir. Genellikle spina bifida, fetusun omurilik kısmının uygun şekilde kapanamadığı gebeliğin üçüncü ve dördüncü haftalarında meydana gelir. Spina bifidanın etiyolojisi heterojendir. Sendromik olmayan spina bifidaların çoğunun hem genetik hem de çevresel faktörlerin etkisiyle multifaktöriyel kökenli olduğu düşünülmektedir. Spina bifida riskinin artmasıyla ilişkili çevresel faktörler arasında gebelik ağırlığının artması, annenin sigara içmesi, özellikle antiepileptik ilaçlar olmak üzere ilaç alımı ve annenin diyabet ve hipertermi gibi hastalıkları yer almaktadır. Ayrıca klorlu su tüketimi, inositol alımı, basit şeker alımı ve eser elementlerin ve diğer mikro besinlerin alımı gibi diyet faktörleride spina bifidaya neden olduğu tahmin edilmektedir. Fakat hala hastalığın net nedeni tespit edilememiştir. Yüksek maternal serum alfa-fetoprotein seviyeleri genellikle spina bifida aperta'nın göstergesidir ancak ikiz gebelik gibi farklı durumlarda da AFP seviyesi arttığı için tanıyı doğrulamak için ultrason gereklidir. Tarama amaçlı obstetrik ultrasonografi, birçok ülkede gebelik sırasında hastalığın saptanması için ilk rutin yöntemdir. Ancak bazen kapalı spina bifidayı tespit etmekte başarısız olmaktadır. Spina bifida tanısını koyan kesin bir biyokimyasal markır olmadığı için, bu alanda ciddi araştırmalar devam etmektedir. Günümüzde bu tür hastalıkların tanı ve tedavisi için metabolomik alanında ciddi çalışmalar yapılmaktadır. Metabolomik çalışmalarında aminosit, karnitin, yağ asidi ve organik asid profili gibi çeşitli metabolitler incelenmektedir. Bu çalışma; spina bifidalı bireylerin serbest aminoasit profili LC-MS/MS yöntemiyle incelenerek, aminoasitlerin hastalığın hem tanısında hemde tedavisinde kullanılabilme potansiyeli tespit etmek amacıyla yapıldı. ix Çalışmada harran üniversitesi araştırma ve uygulama hastanesi Beyin cerrahisi bölümünde spina bifida teşhisi konmuş 40 hasta ve 40 sağlıklı çocuğun plazma örnekleri kullanıldı. Plasma örneklerindeki 48 serbest aminoasit profili LC-MS/MS ile incelendi. Elde edilen dataların analizi SPSS ve metaboanalist 5 ile yapıldı. Çalışma sonucunda kontrol gurubuna göre spina bifida biraylerine Sarkozin ve Glutamik Asit Aminoasitleri anlamlı bir şekilde artarken,4-OH-Prolin ve Triptofan aminoasitleri anlamlı bir şekilde azaldığı tespit edildi
Alkole bağlı olmayan karaciğer yağlanması tedavisinde nano-enkapsüle ilaçların etkinliğinin LC/Q-TOF MS ile gerçekleştirilen metabolomik ve lipidomik çalışmalarla in vitro değerlendirilmesi
Bu tez çalışmasında alkole bağlı olmayan karaciğer yağlanması (NAFL) tedavisinde amfifilik siklodekstrin nanopartiküller kullanılarak geliştirilen nano-enkapsüle ilaçların etkinliğinin lipid profili üzerinde meydana getirdiği değişikliğin Q-TOF LC/MS sistemi kullanılarak in vitro düzeyde değerlendirilmesi hedeflenmektedir. Bu amaçla; halihazırda tedavide kullanılan çeşitli ilaçlar ve E vitamini kullanılarak geliştirilen nano-enkapsüle formülasyonlar, karaciğer kanseri hücre hattı HEPG2'ye uygulanacaktır. Aynı anda; ilaçlar ve E vitamini, enkapsüle edilmeden de HEPG2 hücrelerine uygulanacak ve de iki grup arasında lipid profilinde gerçekleşen değişim Q-TOF LC/MS cihazı kullanılarak C18 kolon ile gerçekleştirilecek çalışma sonucunda ortaya konulacaktır. C18 kolon kullanılarak gerçekleştirilecek çalışmada, öncelikle analitik yöntem ile ilgili şartların optimize edilmesi gerekecektir. Bu amaçla lipidlerin, hücre hattından ekstraksiyonu için çeşitli numune hazırlama teknikleri denenecektir. Daha sonrasında ekstre edilen lipidlerin ayrılması ve analiz edilebilmesi için sabit faz ve hareketli faz ile elüsyon programında değişiklikler yapılarak en yüksek sayıda lipidin profillenebilmesi için çalışılacaktır. Profillenebilen lipidler, her iki grup için yarı-kantitatif olarak karşılaştırılacak ve değişimin her bir tanımlanabilen lipid için ne düzeyde olduğu incelenecektir. Ardından, değişen lipid profili yorumlanarak nano-enkapsüle ilaç kullanımının avantaj ve dezavantajları değerlendirilecektir.
Glioblastoma multiforme, menenjiyom (birincil) ve metastaz (ikincil) beyin tümörlerine ait fenotiplerin belirlenmesinde kullanılacak bütünleşik omiks analizler için analitik yöntem geliştirilmesi ve uygulanması
Genotip ve fenotip arasındaki doğrudan nedensel ve fonksiyonel bağlantıları göstermek için protein, metabolit ve lipit gibi ara moleküler seviyelerin kapsamlı şeklilde incelenmesi çok önemlidir. Kapsamlı metabolomik ve lipidomik analizler için birden çok analitik tekniğe ve analiz koşullarının optimizasyonuna ihtiyaç vardır. Çalışma kapsamında metabolomik analizler eş zamanlı olarak GC-MS ve LC-qTOF-MS ile lipidomik analizler ise LC-qTOF-MS ile gerçekleştirilmiş ve kullanılan analitik yöntemler çeşitli deneysel tasarımlar ile optimize edilmiştir. Plazma örnekleri için metanol:su:kloroform (3:1:3, h/h/h), doku örnekleri için ise metanol:su:diklorometan (2:1:3, h/h/h) metabolitlerin, lipitlerin ve hatta proteinlerin tüketilmesi için optimum çözücü karışımları olarak belirlenmiştir. Doku örneklerinin GC-MS temelli metabolomik analizleri için sililleme reaktifinin inkübasyon süresi ve sıcaklığının, metoksiamin derişimi-metanol hacmi etkileşiminin, plazma örnekleri içinse metoksiamin derişimi ile sililleme reaktifinin inkübasyon süresinin ve metanol-metoksiamin hacmi etkileşiminin analiz sonuçlarını etkileyen önemli parametreler olduğu belirlenmiştir. LC-qTOF-MS temelli metabolomik analizler için uçurulan örneklerin yeniden çözülmesinde kullanılan hareketli faz bileşiminin hem doku hem de plazma örneklerinden yapılan analizlerin sonuçlarını etkilediği tespit edilmiştir. LC-qTOF-MS temelli metabolomik ve lipidomik analizlerin kromatografik koşullarına etki eden parametreler ise Box-Behnken tasarımı ile optimize edilmiştir. Metabolomik ve lipidomik analizler için geliştirilen analitik yöntemler beyin tümörlü hasta grupları ile kontrol grubunu oluşturan bireylerden toplanan doku ve plazma örneklerine uygulanmış ve bu tümörlere ait fenotipler aydınlatılarak sonuçlar klink açıdan bütüncül olarak değerlendirilmiştir.
Preeklampsi hastalığının erken tanısına yönelik hedeflenmiş metabolomik çalışmalar için GC-MS yöntemi geliştirilmesi
Preeklampsi, insan gebeliğine özgü, nedeni bilinmeyen çok sistemli bir hastalıktır. Artan sistemik vasküler rezistans, artmış trombosit agregasyonu, pıhtılaşma sisteminin aktivasyonu ve endotelyal disfonksiyon ile ilişkili yerleşime anormal vasküler tepki ile karakterizedir. Metabolomik, biyolojik bir sistemdeki tüm metabolitlerin geniş çaplı analizi olup sistemdeki daha düşük moleküler ağırlıklı analitlerin (˂1800 Da) nicel değerlendirmesini ortaya koyduğundan transkriptomik ve proteomik analizlerini tamamlayıcı niteliktedir. Tez çalışmasında preeklampsi hastalığının erken tanısında ayırıcı olduğu düşünülen 2-hidroksi bütirik asit, piroglutamik asit, glutamik asit, 4-hidroksi glutamik asit, N-asetil L-glutamik asit ve N-karbamil L-glutamik asit seçilmiştir. Söz konusu metabolitlerin analizleri %5 difenil %95 dimetilpolisiloksan (30 m × 0,25 mm, 0,25 μm) kapiler kolon ile 60oC (1 dk), 10o C/dk ile 200oC sonra 30oC/dk ile 320oC (5 dk) fırın sıcaklık programında, hareketli faz olarak helyum ve akış hızı 0,99 mL/dk ve iç standart olarak miristik asit-d27 kullanılarak GC-MS yöntemi ile yapılmıştır. Geliştirilen yöntem, özgünlük, doğrusallık, duyarlılık, doğruluk, kesinlik, sağlamlık, kararlılık ve sistem uygunluk parametreleri değerlendirilerek valide edilmiştir. Geliştirilen ve valide edilen yöntem boş plazmaya uygulanarak ortalama geri kazanım değerlendirilmiştir. Anahtar kelimeler: Preeklampsi metabolitleri, Gaz Kromatografisi-Kütle Spektrometrisi, Metabolomiks
Protein esaslı biyoterapötik ilaçların iyon hareketliliği kütle spektrometresi ile karaterizasyonları
Son yıllarda protein temelli tedavi edici ilaçların önemi ciddi oranda artmıştır. Bu ilaçlar hücre kültürü ortamlarından veya belirli canlılar üzerinden üretilerek elde edilmesi bu tarz ilaçların kimyasal olarak sentezlenmiş ilaçlardan ayırmaktadır. Bu ilaçlar kanser, diyabet gibi hastalıkların tedavisinde kullanılan tedavi edici özelliğe sahip ilaçlardır. Bu ilaçların hastalıklara karşı efektif bir şekilde tedavi edici rol oynaması için yapısının hastalığa etki edecek şekilde özgün olması gerekmektedir. Bu ilaçlar üretim ve onaylanması sırasında birçok önemli aşamadan geçmektedir. Bu tarz ilaçlar protein esaslı oldukları için üretimleri ve üretim sonrasındaki aşamalarında meydana gelen enzimatik ve kimyasal modifikasyonlar bu ilaçların işlevlerinde ve yapılarında çeşitlilik gösterebilmektedir. Yapılarında meydana gelen bu tarz modifikasyonlara Post-Translasyonel Modifikasyon adı verilir. Bu modifikasyonlar arasında glikozilasyon en önemlilerinden bir tanesidir. Kütle Spektrometrisi protein esaslı tedavi edici özelliğe sahip ilaçların dizilim, bileşim, yapı, konformasyon ve kütle gibi birçok özelliğinin aydınlatılmasında kullanılan güçlü bir analitik yöntemdir. Kütle Spektrometrisi protein esaslı biyoterapötik ilaçların analizlerinde yoğun bir şekilde kullanılmaktadır. Fakat bu analitik teknikler özellikle aynı kütle/yük oranına sahip farklı konformasyonel özellikleri taşıyan formlarda analizlerde genellikle ayrım sağlayamamaktadır. Yumuşak iyonlaştırma tekniğine sahip İyon Hareketliliği Kütle Spektrometrisi özellikle aynı kütle/yük oranına sahip farklı konformasyonel özellikleri olan türlerin analizlerinde önemli rol oynamaktadır. Yumuşak iyonlaştırma tekniği sayesinde iyonlar hareketlilik tünelinin içine girerek şekil, boyut ve yük gibi özelliklerine göre ayrımları sağlanıp konformasyonel özellikleri hakkında bilgi elde edilebilir. Bu tez kapsamında insan serumunda yer alan immunglobulin g (IgG) ve ilaç olarak kullanılan, trastuzumab ve bevacizumab monoklonal antikorların N-glikan profillerinin konformasyonel düzeyde analizleri gerçekleştirilmiştir. Bu analizlerde iyon hareketliliği kütle spektrometrik yöntemlerden olan tuzaklamalı iyon hareketliliği kütle spektrometrisi kullanılmıştır. Glikan analizleri için kütle spektrometrik cihazlarda iyonlaşmadaki avantajı sebebiyle prokainamid etiketi kullanılmıştır. Bu analizlerde eş zamanlı olarak hidrofilik etkileşim kromatografisi temelli floresans ve iyon hareketliliği kütle spektrometrik yöntemler kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Yapılan analizlerde IgG ve mAb'ların glikan formları elde edilmiş ve konformasyonel açıdan glikan yapıları tespit edilmiştir. Yapılardaki her bir glikan formunun etkin çarpışma kesiti hesaplanıp birbirleriyle karşılaştırılması gerçekleştirilmiştir. Özellikle glikan formlarının CCS değerlerinin, esas olarak yapılarındaki galaktoz ve fukoz birimlerinin varlığı ve bağlanma durumlarındaki farklılıklara göre değişiklik gösterdikleri tespit edilmiştir.. Bu tez çalışmasında tuzaklamalı iyon hareketliliği kütle spektrometrisi cihazı ile ilk kez IgG ve monoklonal antikorların glikan formlarının konformasyonları hakkında bilgi elde edinilmiş olup ve eş zamanlı olarak floresans dedektör kullanılarak analizler gerçekleştirilmiştir. Literatüre güçlü bir analitik yöntem kazandırılmıştır.
Proteinlerin çözelti ve gaz fazındaki konformasyonlarının tuzaklı iyon hareketliliği-kütle spektrometrisi kullanılarak incelenmesi
Gaz fazındaki protein konformasyonunun çözelti fazındaki konformasyonu yansıtıp yansıtmadığı hakkında literatürde birçok yöntemle açıklamalar yapılmaya çalışılmakta olup henüz bu konu tam anlamı ile açıklığa kavuşturulmuş durumda değildir. Literatürde bu alanda yapılan çalışmalarda çözelti fazındaki proteinin pH, sıcaklık, iyon şiddeti değişimi ve çözücü gibi parametrelerin değiştirilmesi sonucunda meydana gelen çözelti fazındaki protein konformasyon değişikliklerinin proteinin gaz fazındaki konformasyonunun değişimi üzerindeki etkileri incelenmektedir. Bu tez kapsamında gaz fazındaki protein konformasyonunun, çözelti fazındaki protein konformasyonunu ne kadar yansıttığı açıklığa kavuşturulmaya çalışılmıştır. Proteinlerin farklı çözelti koşullarına ek olarak polistren sülfonat polimeri ile etkileşimi sonucunda çözeltide gerçekleşen değişimlerin gaz fazına yansıyıp yansımadığı hakkında çalışmalar yapılmıştır. Bu çalışmada çözeltide meydana getirilen değişimlerin (metanol eklenmesi ile yapının denatüre olması, iyon kaynağı sıcaklığının değiştirilmesinin etkin çarpışma kesiti üzerine etkileri, pH değişimi ile yapının pI noktasına ilerledikçe kompakt konformerlerin görülmesi gibi) proteinin gaz fazındaki konformasyonel özelliklerine yansıdığı gözlenmiştir. Literatürde pH ve organik çözelti değişimlerinin model proteinlerin konformasyonları üzerindeki etkilerinin incelendiği birçok çalışma bulunmaktadır. Bu nedenle, bu tez çalışmasındaki analizlerin literatüre daha fazla katkıda bulunabileceği düşünülen fizyolojik koşullarda yürütülmesi gerektiği düşünülmüştür. Tez kapsamında özellikle ESI-MS analizlerinde fizyolojik koşullara yakın koşulların sağlanması amacıyla yaygın olarak kullanılmakta olan amonyum asetat tuzunun protein yapıları üzerindeki etkileri incelenmiştir. Bu analizler sonucunda elde edilen veriler değerlendirildiğinde, proteinin amonyum asetat çözeltisi içerisinde sadece su içerisinde olmasına kıyasla daha kompakt bir konformasyona sahip olduğu sonucuna varılmıştır. Aynı zamanda amonyum asetat derişimindeki değişikliğin polimer-protein etkileşimlerine de etki ettiği görülmüştür. Polimer-protein etkileşimleri sonucunda çözeltide oluşan kompleksler gaz fazında da görülmüş ve bu komplekslerin bazı yüklerde kompaktlaştığı hakkında bilgiler edinilmiştir. Protein ile etkileşen polimerin zincir uzunluğu arttıkça, protein yapısının kapandığı belirlenmiştir. Etkileşimlerin daha iyi açıklanabilmesi adına moleküler dinamik simülasyonlardan faydalanılmıştır. Söz konusu konformasyonel etkilerin gaz fazında mı yoksa çözelti fazında mı gerçekleştiğinin anlaşılabilmesi için simülasyonlar kaba tanecikli modelleme ile Martini3 alan kuvveti ve GROMACS programı kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Simülasyon sonuçlarına göre bu kompleksleşmenin büyük çoğunluğunun çözelti fazında gerçekleştiği ve kompleksin gaz fazında korunduğu yönündedir.
Kefirin fermantasyonu ve depolanması süreçlerinde süt protein n-glikanları ve serbest süt oligosakkaritleri profillerindeki değişimin incelenmesi
Kefir, kökeni Kafkas dağlarına dayanan kadim bir besin kaynağıdır. Kefir, çoğunlukla kefir mikroorganizmalarının inek sütü kullanılarak fermantasyonu ile üretilir. Kefirin insan sağlığına faydalarını gösteren birçok çalışma bulunmaktadır. Kefir üretimi sırasında sütün önemli bileşenlerinde meydana gelen değişiklikler net olarak bilinmemektedir. Bu çalışmada, kefirin fermantasyonu ve depolanması süreçlerinde süt glikoproteinleri N-glikanlarının ve sütte bulunan serbest süt oligosakkaritlerin süreç içerisindeki değişimlerinin incelenmesi amaçlanmıştır. Bu amaçla kefirin fermantasyonu ve depolanması sırasında belirlenen her bir süre için N-glikanlar süt glikoproteinlerinden enzimatik bir süreçle ekstrakte edilmiş ve MALDI-MS ile analizleri gerçekleştirilmiştir. Benzer şekilde sütte bulunan serbest süt oligosakkaritler de kefirin fermantasyonu ve depolanması süreçlerinde örneklerden ekstrakte edilmiş ve analizleri gerçekleştirilmiştir. Toplamda 57 adet N-glikan ve 19 serbest süt oligosakkariti analizlerde karakterize edilmiş ve süreç içerisindeki değişimleri belirlenmiştir. İstatiksel analizler sonucunda 7 farklı N-glikan türünde H5N4, H8N2, H5N4F1, H4N5F1, H3N6F1, H9N2, H4N5S1F1 ve 2 farklı oligosakkarit tipinde (laktoz-, -Hex2 ve trioz-, -Hex3) süreç içerisinde anlamlı değişikliklerin olduğunu göstermiştir (p<0.05). Bu çalışmanın kefir üzerine yapılacak kliniksel ve mekanistik çalışmaların detaylı değerlendirilmesine yardımcı olması beklenmektedir.
Klinik candida ve aspergillus suşlarının antifungal duyarlılık profillerinin matriks ile desteklenmiş lazer desorpsiyon/iyonizasyon uçuş zamanı kütle spektrometresi ("MALDİ-TOF MS") yöntemi ile değerlendirilmesi
Dirençli Candida ve Aspergillus türlerinin neden olduğu invaziv mantar enfeksiyonları küresel bir halk sağlığı sorunudur. Antifungallere direncin giderek arttığı göz önüne alındığında antifungal duyarlılık testi (AFDT) giderek daha önemli hale gelmekte ve hızlı sonuç veren yöntemlere ihtiyaç duyulmaktadır. Bu çalışmada, Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikoloji Laboratuvarı'nda hasta örneklerinden izole edilen Candida ve Aspergillus suşlarının tedavide sıklıkla kullanılan azol ve ekinokandin grubu antifungal ilaçlara duyarlılıklarının MALDI-TOF MS yöntemi ile saptanarak elde edilen sonuçların EUCAST referans sıvı mikrodilüsyon yöntemi sonuçları ile karşılaştırılması ve böylece, MALDI-TOF MS yönteminin in vitro antifungal duyarlılık profillerinin saptanmasındaki doğruluğunun ve tekrarlanabilirliğinin tespit edilmesi amaçlanmıştır. 40 Candida glabrata izolatının anidulafungin ve flukonazol, 40 Candida albicans ve 40 Candida parapsilosis izolatının flukonazol, 4 Aspergillus fumigatus izolatının vorikonazol duyarlılıkları test edilmiştir. Candida izolatları "yüksek" ve "sınır değer" olarak iki farklı antifungal konsantrasyonunda ve ilaçsız kontrolde 3 saat inkübe edilmiştir (Anidulafungin: 16, 0.06, 0 mg/L; Flukonazol: 256, 16, 0 mg/L). A. fumigatus izolatları seri vorikonazol konsantrasyonlarında (32-0.03 mg/L) ve ilaçsız kontrolde 15 saat inkübe edilmiştir. Bu konsantrasyonlardan elde edilen MALDI-TOF MS spektrumları ile her izolat için ayrı bileşik korelasyon indeksi (CCI) matrisi oluşturulmuştur. Candida türleri için sınır değerdeki ve en yüksek ilaç konsantrasyonundaki spektrumların korelasyonundan elde edilen CCI değeri ortalaması, sınır değer ve ilaçsız kontrolden elde edilen CCI değeri ortalamasından yüksek olduğunda, suş ilaca duyarlı olarak sınıflandırılmıştır. A. fumigatus için maksimum vorikonazol konsantrasyonu spektrumuyla olan benzerliği, ilaçsız kontrol spektrumuyla benzerliğinden fazla olan ilk spektrumun ilaç konsantrasyonu minimum profili değiştiren konsantrasyon (MPCC) olarak belirlenmiştir. Sınıflandırmalar EUCAST sıvı mikrodilüsyon yöntemine göre elde edilen minimum inhibitör konsantrasyonların duyarlı veya dirençli sınıflandırmalarıyla karşılaştırılmıştır. Genel olarak MS-AFDT ve EUCAST AFDT arasındaki uyum %60 ila %85 arasında değişmiştir ve en yüksek oranda C. glabrata için anidulafungine karşı olmuştur. MS-AFDT testinin tekrarlanabilirliği %45 ila %75 arasında değişmiştir ve C. parapsilosis flukonazol duyarlılık testi en tutarlıdır. 4 A. fumigatus suşu için uyum ve tekrarlanabilirlik tam olarak bulunmuştur. Sonuçlar, daha ileri çalışmalarla metodolojinin iyileştirilmesi ve testin tekrarlanabilirliğinin geliştirilmesiyle birlikte MALDI-TOF MS'nin Candida ve Aspergillus türlerinde tanımlama ve antifungal duyarlılık sınıflaması için aynı anda kullanılabileceğini göstermektedir.
Kolestaz hastalarında safra asitlerinin LC-MS/MS ile araştırılması ve olası biyobelirteçlerin belirlenmesi
Kalıtsal safra asidi sentez bozuklukları (IEBAS) safra asitlerinin sentez yollarında görev alan enzimlerde yapısal veya işlevsel bozukluklar sonucu alışılmadık ara metabolitlerin birikmesine neden olan otozomal ressesif geçişli hastalıklar grubudur. Tedavi edilmediğinde nörolojik semptomlarla ilerleyen ve ölümcül karaciğer hastalığı ile sonuçlanan bu durumda erken tanı oldukça önemlidir. Bu çalışmada nadir görülen, tanısı güç olan ancak tedavi edilebilir bu hastalıkların erken tanısında kullanılabilecek yöntem ve bunlara yönelik olası biyobelirteçlerin belirlenebilmesi amaçlandı. Kuru kağıda emdirilmiş idrar örneklerinde LC-MS/MS yöntemi ile altmış sekiz safra asidi ara metabolitleri hedefli metabolomik analiz ile değerlendirildi. Plazma örneklerinde 5α-kolestanol ve 7-dehidrokolesterol ara metaboliti ve kolesterol ölçümü GC-MS yöntemiyle değerlendirildi. Hastalar ile sağlıklı bireylerin total safra asit değerleri arasında (p=0,001), klasik safra asit değerleri arasında (p=0,001), hidroksile safra asit değerleri arasında (p=0,001), 3β-hidroksi-Δ5-safra asit değerleri arasında (p=0,002) ve 3-okzo-∆⁴-safra asit değerleri arasında (p=0,001) anlamlı bir fark olduğu bulundu. Bir hastada 3β-hidroksi-Δ5-steroid dehidrogenaz eksikliği, bir hastada oksisterol-7α-hidroksilaz eksikliği, 3 hasta serebrotendinöz ksantomatozis tanıları ile uyumlu idrarla atılan safra asidi ara metabolitleri tespit edildi. Kolesterol ve kolestanol değerleri arasında (p=0,570 ve p=0,099) anlamlı bir fark olmadığı bulundu. 7-dehidrokolesterol değerleri arasında anlamlı bir fark olduğu bulundu (p=0,008). Bu bulgular safra asit sentez yolaklarında görev alan enzim eksikliklerinin bir sonucu olarak açığa çıkan ara metabolitlerin idrarda ve plazmada tespit edilebilmesinde ve bu bozuklukları öngörmede hedefli kütle spektrometri yönteminin etkili olduğunu göstermektedir.
Anormal implantasyon ve plasentasyona bağlı gelişen gebelik komplikasyonlarına sahip gebelerde saçta metabolomiks analizi
Preeklampsi (PE), HELLP sendromu gibi gebelik komplikasyonları, benzer patofizyolojik mekanizmalarla ortaya çıkan, mortalite ve morbiditesi yüksek olan, sadece gebeliğe özgü hastalıklardır. Etiyolojisi halen bilinmeyen, hem anne hem de fetüsün sağlığı üzerinde olumsuz etkileri olan bu hastalıkların tarama, erken teşhis, takip ve tedavisinde kullanılabilecek sağlam biyomarkırları tanımlamak amacıyla, ilk kez bu araştırmada, yeni doğum yapmış annelerin saç örneklerinde ileri kromatografik tekniklerden olan gaz kromatografi-kütle spektrometresi (GC-MS) kullanılarak metabolomiks analizi yapıldı. Araştırmaya PE, HELLP sendromu ile takip edilen veya kliniğe başvuran 29 hasta ve 21 sağlıklı gebe katıldı. Katılımcılardan saç örneği alınarak gebelik trimesterlerine göre 3 cm'lik segmentlere ayrıldı ve GC-MS'de saçta metabolomiks analizi yapıldı. Bulunan sonuçlar trimesterlere göre anlamlı değişiklik göstermiştir. Hasta ve kontrol grupların metabolom profillerinin karşılaştırılması sonucu hasta grubunda araştırılan tüm 100 metaboloitin hepsinde çarpıcı düşüş görülmüştür (p<0,000). Anlamlı bulunan metabolitlerin ilişkili olduğu metabolik yolaklar da araştırılmış ve en çok etkilenen yolakların üre siklusu, glisin, serin, aspartat, metiyonin pürin metabolizması, amonyak döngüsü, fosfatidiletiyoninamin biyosentezi olduğu görülmüşür. Bulunan metabolitler bize PE'nin öngörülmesi, erken teşhisi ve takibi açısından biyobelirteç oluşturulabilmesi ile ilgili geniş bir veri sağlamaktadır. Anahtar kelimeler: Metabolomiks, Saç, Preeklampsi, HELLP sendromu, GC-MS
Sıvı kromatografisi-tandem MS metodu ile granülositlerde lökosit sistin ölçümünün geliştirilmesi
Sistinoz, sistin taşınmasındaki bozukluğa bağlı olarak lizozomlarda sistin birikmesine yol açan nadir bir kalıtsal bozukluktur. Sisteamin tedavisi ile glomeruler hasar geciktirilir. Sistinoz tanısı ve sisteamin tedavi takibinde lökositlerde sistin konsantrasyonu ölçümü altın standarttır. Bu tez çalışmasında, lökosit içi sistin konsantrasyonu ölçümü için, duyarlılık ve doğruluğu yüksek bir ESI tandem MS metodunun geliştirilmesi amaçlanmıştır. Örnekler ACD tüplere alındı ve granülosit izolasyonu yapıldı. Sisteinin sisteine oksidasyonunu ve SH grupları ile interferansı önlemek için N-etilmaleimid kullanıldı. Sistin, 3N butil-HCl ile türevlendirildikten sonra di-butil ester türevi ESI tandem MS ile ölçüldü. Metodun 0 - 41.38 mol/L aralığında lineer olduğu saptandı. Çalışma içi ve günler arası presizyon (%CV) <% 6 ve kantitasyon limiti (LoQ) 0.095 mol/L idi. Geri elde % 92.2-107.4 olarak bulundu. Anlamlı bir carry over izlenmedi. Hemolizin anlamlı interferansa neden olduğu izlendi (bias %20). Sistinin -80 0C derecede saklanan örneklerde 30 gün stabil kaldığı ve don-çöz yapılmaması gerektiği bulundu. Sonuç olarak, bu çalışmada granülositlerde sistin ölçümü için yeni bir ESI-tandem MS metodu geliştirilmiştir. Sistein oksidasyonu ve sistinin disülfid değişim reaksiyonları NEM ile engellenmiştir. Analitik değerlendirme yöntemin yeterli olduğunu göstermiştir. Elde edilen kanıtlar göz önüne alındığında, bu metod sistinoz ve sisteamin takibinde lökosit içi sistin konsantrasyonu ölçümü için uygundur. Klinisyenler testi güvenilir bir şekilde rutin ölçümlerde kullanabilir.
Sülfür metabolizmasinda yer alan metabolitlerin miktar tayini için LC-MS/MS yönteminin geliştirilmesi ve valide edilmesi
Sülfür metabolitleri, hücresel fonksiyonda kritik roller oynarlar. Sülfür bileşiklerinin düzeylerindeki ve metabolizmasındaki değişikliklerin kanser ile ilişkilendirilmesi bu bileşiklerin klinikte hassas, doğru ve hızlı miktar tayinlerini yapabilme gereksinimini doğurmuştur. Özellikle biyolojik sorulara cevaplar ararken, spesifik metabolitlerin derişimlerinin doğru ve kesin olarak bilinmesi gerekir. Bu tür analizler hedeflenmiş metabolomiks çalışmalar ile elde edilebilir. Bu çalışmalarda LC-MS/MS yaklaşımları, üstün seçiciliği ve duyarlılıkları nedeniyle yaygın olarak kullanılmaktadırlar. Tez çalışmasında kısa analiz süresine (12 dk) sahip ve türevlendirme aşaması gerektirmeden sülfür metabolizmasinda yer alan metabolitlerin eş zamanlı analizi için yeni bir LC-MS/MS yöntemi sunulmuştur. Yöntem, metabolitler için 0,05-10 µg/mL aralığında doğrusal bulunmuştur. Geliştirilen yöntem validasyon çalışmaları ile seçici, kesin, doğru, duyarlı, doğrusal ve sağlam bulunmuştur. Geliştirilen yöntem insan hepatoselüler karsinom (HepG2), insan akciğer adenokarsinom (A549), insan sağlıklı akciğer epitel (BEAS-2B), insan kolorektal adenokarsinom (Caco-2) ve insan sağlıklı kolon epitel (FHC) hücre hatlarına uygulanarak sülfür metabolitlerinin miktarları belirlenmiştir.
İnsan serum bütirilkolinesterazının olası lipolitik aktivitesi-lipid metabolizması ile ilişkisi
Kolinesterazlar (AChE ve BChE), başlıca kas-sinir kavşaklarındaki kolinerjik sinapslarda asetilkolin uyarılı nörotranmisyonu sonlandırır. BChE ekspresyonunun esansiyel yağ asitleri tarafından düzenlendiğini daha önce göstermiştik. Lipazların ve kolinesterazların (ChE) katalitik bölgesinin benzeşmesi, ChE'lerin da çeşitli lipit ve fosfolipitleri hidroliz edebilecekleri hipotezini öne sürmemize neden oldu. ChE'lerin serbest yağ asitleri, trigliseritler ve fosfatidilkolin-sfingomiyelin gibi zar fosfolipitlerinin olası hidrolizi kromatografik ve spektrofotometrik-florometrik yöntemlerle incelendi. Ticari BChE-AChE ve insan plazmasından saflaştırılan BChE'nin lipolitik aktiviteleri farklı kaynaklardan kontrol enzimleri (Pankreatik (PanL) ve buğday tohumu (BTL) lipaz, fosfolipaz (PLA2), sfingomiyelinaz) ile birlikte değerlendirildi. BChE'nin PLA2 ve sfingomiyelinaz aktiviteleri tarandı. BChE'nin kısmi PLA2 aktivitesi gösterdiği, ancak sfingomiyelinaz aktivitesi göstermediği bulundu. Substrat olarak serbest yağ asidi hidrolizi, 4-mu palmitat ile gerçekleştirildi. Sonuçlar, saflaştırılan BChE'nin 4-mu palmitat'ı BTL kadar etkin hidroliz edebildiğini gösterdi. Michaelis-Menten kinetik sonuçları substrat olarak 4-mu palmitat kullanan enzimlerin afinitesini şu şekilde sıralar: BTL (10,4 µM)> Safl BChE (34,2 µM)> PanL (129,8 µM)> tic BChE (186 µM). Kolinesterazların trioleik asit (TO) hidrolizi GC-MS ve LC-MS/MS ile analiz edildi. TO hidrolizinin GC-MS sonuçları, saflaştırılan BChE'nin PanL'nin %7'si kadar oleik asiti ortama saldığını gösterdi. LC-MS/MS sonuçları PanL'nin diğer enzimlerden daha yüksek TO hidrolitik aktivitesi (18593 ppm/dk/mg protein enzim) olduğunu gösterdi (p<0,001). TO hidroliz yetisi olduğu bugüne kadar gösterilmemiş olan saflaştırılan BChE'nin aktivite değeri (714,3 ppm/dk/mg protein enzim), BTL'den (80,7 ppm/dk/mg protein enzim) daha yüksekti (p=0,024). Aynı çalışmalar ticari AChE ile gerçekleştirildi. Ancak AChE'nin adı geçen substratları hidroliz etmediği gözlendi. BChE aktivitesinin spesifik inhibitörü IsoOMPA varlığında ve BChE'nin lektin afinite kromatografisi sonrası elde edilen süpernatanda lipolitik aktivitesi çok düşüktü. Bu sonuç lipolitik aktivitenin BChE'ye ait olduğunu ve BChE'nin 4-mu palmitat ile trioleik asiti hidroliz ettiğini göstermektedir.
Hepg2, CACO-2 ve HT-29 kanser hücrelerinde 2D jel elektroforez ve MALDI-TOF/TOF-MS ile ankaferd hemostat' ın in-vitro antineoplastik etkisinin proteomik açıdan araştırılması
Yaşam bilimlerinde çığır açan keşiflerden biri insan genom projesinin tamamlanmasıyla gerçekleştirilmiştir. Ancak tüm genom haritasının oluşturulması, bilim adamları için zorlu bir görevi de beraberinde getirmiştir. Bu görev insan proteomunun karakterizasyonudur. Proteomik araştırmalar, moleküler seviyede değişim gösteren proteomların analizinin yapıldığı çalışmalardır. Onkoproteomik, kanser hücresindeki protein etkileşimlerini içeren proteomik teknolojilerin kullanıldığı proteomiklerin bir koludur. Kanser patogenezinin daha iyi anlaşılmasını sağlamak, tanı için yeni tümör biyobelirteçleri geliştirmek ve örneklerin proteom profili kullanılarak erken tespit ve teşhisi sağlamak için onkoproteomik çalışmalar yapılmaktadır. Bu tez çalışması kapsamında, Caco-2 ve HT-29 kolon kanseri ve HepG2 karaciğer kanseri hücre hatları, Ankaferd Hemostat (ABS; Ankaferd Blood Stopper®) ile farklı sürelerde muamele edilmiştir. ABS ile muamele edilen hücreler (işlenmiş, T grubu) ve muamele edilmeyen hücreler (kontrol, C grubu) üzerinde karşılaştırmalı proteomik çalışmalar yapılmıştır. Proteomik çalışmalarda, 2 boyutlu jel elektroforezle ayrılan C ve T gruplarına ait proteinler için imaj analizi çalışmaları yapılmıştır. C ve T grupları karşılaştırıldığında, nicel anlamda en az 2 kat farklılaşan proteinler, MALDI-TOF/TOF-MS ile analiz edilmiş ve peptid dizileme çalışmalarıyla tanımlanmıştır. Tanımlanan proteinler Uniprot ve SwissProt gibi veri tabanlarında taranıp yapıları, fonksiyonları, gen adları ve protein-protein etkileşimleri belirlenmiştir. String veri tabanı aracılığıyla da ABS' nin, kanser hücrelerinde etkilediği biyolojik süreçler ve yolaklar tespit edilmiştir. Anahtar Kelimeler: Proteomik, Kolon kanseri, Karaciğer kanseri, İki boyutlu (2D) jel elektroforez, MALDI-TOF/TOF-MS, Protein etkileşimleri, Ankaferd Hemostat. Bu tez çalışması 114S500 no' lu TUBİTAK projesi ve 17656 no'lu Hacettepe BAB Projesi tarafından desteklenmiştir.
Metabolomik ve fluksomik çalışmalar ile kolon kanserinde kemoterapötiklere karşı direncin in vitro değerlendirilmesi
Günümüzdeki yenilikçi teknolojiler sayesinde omiks (genomik, transkriptomik, proteomik, metabolomik ve fluksomik) gibi karmaşık analizler yapılabilmektedir. Omik analizlerden elde edilen detaylı bilgi; hastalıkların mekanizmasını anlamak, erken teşhisini kolaylaştırmak, bireysel tedavi stratejilerini seçmek ve bunların etkinliğini değerlendirmek için büyük bir potansiyele sahiptir. Metabolomik fenotipinin belirlenebilmesi için çok sayıdaki metabolitin eş zamanlı ve kapsamlı analizlerinin yanı sıra döngü hızlarının da belirlenmesini gerektirir. Tez çalışmaları kapsamında kolorektal kanseri in-vitro modeli olan insan kolon adenokarsinom hücre hatlarına (Caco-2) ve kontrol olan insan fötal kolon hücre hatlarının (FHC) kematöratpotiklere karşı gözlenen direnç gelişimine bağlı olarak fenotipde gözlenen değişimler metabolomik, lipidomik ve fluksomik analizler ile incelenmiştir. Fluksomik analizlerde kararlı 18O izotopu işaretleme ajanı olarak kullanılmıştır. Metabolomik, lipidomik ve fluksomik analizlerin gerçekleştirilmesinde GC-MS ve LC-qTOF-MS analitik cihazları kullanılmıştır. Bu analizler sonucunda 300'ün üzerinde metabolit/lipit ve 38 metabolitin 18O işaretlenme yüzdeleri hesaplanmıştır. Tez kapsamında ilk kez 18O kararlı izotopu ile Krebs döngüsü metabolitleri, aminoasitler, yağ asitleri ve oligofosfonükleotitlerin işaretlenme yüzdeleri belirlenmiştir. İstatiksel olarak anlamlı bulunan metabolitler ile gerçekleştirilen yolak analizlerinde malat-aspartat mekiği, aminoasit, amonyak metabolizmaları ile glikoz-alanin ve üre döngülerine ait yolakların dirence bağlı olarak değiştiği gözlemlenmiştir. Elde edilen kapsamlı omiks (metabolomiks, lipidomiks ve fluksomiks) verileri, kemoterapötiklere karşı izlenen direncin hücre dinamiklerindeki farklılıklarını göstermiştir.
Ankaferd hemostat' ın mcf-7 meme kanseri hücre hattına etkisinin proteomik analizlerle incelenmesi
Günümüzde tedavisi en zor olan ve ölümcül hastalıkların başında gelen kanserle ilgili çok sayıda araştırma gerçekleştirilmektedir. Bu araştırmalardan biri olan omik tekniklerden proteomik analizler; kanser, protein düzeyinde incelenerek kanser hastalığının oluşum mekanizması, teşhis ve tedavisi ile ilgili mevcut klinik çalışmalara destek olunmasının yanı sıra yeni alternatiflere ışık tutmaktadır. Bu tez çalışması, MCF-7 meme kanseri hücre hattının Ankaferd Hemostat (ABS; Ankaferd Blood Stopper®) ile farklı sürelerde muamele edilmesi sonucunda, ABS ile muamele edilmemiş (kontrol, C grubu) ve ABS ile muamele edilmiş hücrelerde (işlenmiş, T grubu) gerçekleştirilen karşılaştırmalı proteomik çalışmalar yapılmıştır. Böylece ABS' nin etkisi, MCF-7 meme kanseri hücre hattına in vitro olarak uygulandıktan sonra moleküler düzeyde incelenmiştir. Bu çalışmada, C ve T gruplarına ait proteinler iki boyutlu jel elektroforez ile ayrılmıştır. ABS uygulandıktan sonra azalan veya artan miktarlarda ifade edilen proteinler imaj analizi çalışmaları yapılarak tespit edilmiştir. C ve T gruplarının karşılaştırılması sonucunda nicel olarak en az 2 kat farklılaşmış olan proteinler, matriks destekli lazer desorpsiyon/iyonizasyon, uçuş zamanlı kütle spektrometrisi (MALDI-TOF/TOF-MS) ile analiz edilmiş ve peptid dizileme çalışmaları ile tanımlanmıştır. Tanımlanan proteinler, veri bankaları yardımıyla taranmış ve fonksiyonları ile protein-protein etkileşimleri belirlenmiştir. String ve KEGG veri tabanları aracılığıyla da ABS' nin, kanser hücrelerinde etkilediği biyolojik süreçler ve yolaklar tespit edilmiştir. Elde edilen proteinler, ABS' nin antikanser aktivitesini proteom düzeyinde açıklamak amacıyla kaynaklardaki çalışmalarla ilişkilendirilmiştir. Anahtar Kelimeler: Proteomik, Meme kanseri, İki boyutlu (2D) jel elektroforez, MALDI-TOF/TOF-MS, Ankaferd Hemostat