Metabolomik ve genomik yaklaşımlarıyla Escherichia coli'de benzoik asit ve ferulik asit ile ilgili genlerin araştırılması

Fenolik bileşikler, başta bitkiler olmak üzere farklı canlı gruplarında biyosentezi gerçekleşen sekonder metabolitlerdir. Bu bileşiklerin, bitkilerin UV'ye karşı korunması, patojenlere karşı savunması gibi çevresel streslere karşı yanıtta üretilmeleri, antibakteriyel, antioksidan, antikanser, antiviral gibi birçok önemli aktiviteye sahip olmaları dikkat çekmektedir. Fenolik bileşiklerin biyoaktif özelliğe sahip olmaları ve diyet alımı ile insan sağlığı üzerinde gösterdikleri olumlu etkilerinden dolayı, bu bileşiklerden sağlık sektörü dahil birçok sektörde doğal bileşikler olarak yararlanılmaktadır. Ancak hücre içerisinde hangi genler ve metabolitler ile etkileşim içerisinde oldukları tam olarak bilinmemektedir. Bu bileşiklerin daha etkin bir şekilde kullanılabilmeleri için, canlılar ve insan sağlığı üzerindeki potansiyel rolleri hakkında bilgilerin arttırılması, çalışmaların hücrede gen/genom düzeyinde detaylandırılması, hücre içerisinde etkileşimde olduğu yolakların belirlenmesi gerekmektedir. Bu tez çalışmasında, fenolik bileşiklerden benzoik asit ve ferulik asitin Escherichia coli bakterisinde ilişkili olduğu gen ve metabolitlerin belirlenmesi amaçlanmıştır. Çalışmalarda genomik, gen ekspresyon ve metabolomik analizlerinin yanı sıra, çeşitli mikrobiyoloji deneyleri ve istatistiksel analiz yöntemleri uygulanmıştır. Tezin ilk kısmında, ASKA klon setindeki 4123 adet klonun bir araya getirilmesiyle oluşturulan ASKA plazmit genom boyu kütüphanesi ile genomik çalışmalar yürütülmüştür. ASKA plazmit genom boyu kütüphanesi, gradient ekim yöntemi kullanılarak farklı konsantrasyonlarda benzoik asit ve ferulik asit stresine maruz bırakılmıştır. Benzoik asit gradient ekim seleksiyonundan 91 adet ve ferulik asit gradient ekiminden ise 132 adet göreceli olarak yüksek tolerans seviyesine sahip suş belirlenmiştir. Bu suşların toleranslı olduklarının onaylanması ve ek bir seleksiyon yapılması için çizgi ekim yöntemi kullanılmıştır. Bu bileşiklerle yapılan seleksiyon çalışmaları sonucu toleranslı olduğu onaylanan suşlardan seçilerek koloni PCR yapılmış ve insert büyüklüklerine bakılmıştır. Benzoik asit ile ferulik asit'ten 6'şar adet suş seçilerek plazmit izolasyonu ve sekans analizi gerçekleştirilmiştir. Sekans analizi sonrası insert bilgilerine ulaşılan klonlar, yjtD, yabQ, ydfB, yegP, osmE, hisS (benzoik asit) ile prpE, sbmC ve fliS (ferulik asit) genlerini taşımaktadır. Tez çalışmasının diğer bir kısmında her bileşik için klonlardan seçilerek, yabanıl tip Escherichia coli'de gen ekspresyon analizi yapılmıştır. Real-Time PCR deneylerinde osmE ve prpE genlerinin ekspresyon seviyelerinde artış olduğu gözlenmiştir. Tez çalışmasının son kısmında, benzoik asit ve ferulik asit stresi ile ilgili metabolitlerin belirlenmesinde 1H-NMR analizi kullanılmıştır. 1H-NMR analizi için metabolit ekstraktları, 4 konsantrasyon, 3 tekrar olacak şekilde her bileşik için ayrı ayrı olarak E.coli BW25113 suşu kullanılarak hazırlanmıştır. Benzoik asit'in E.coli BW25113 suşu ile yapılan 1H-NMR analizi sonucu 80 adet metabolit profiline ulaşılmıştır. 80 adet metabolit ile yapılan istatistiksel analizlerde kontrol grubuna kıyasla, 24 adet metabolitin konsantrasyonlarında, en az bir benzoik asit konsantrasyon uygulamasında, anlamlı değişim olduğu gözlenmiştir. Benzoik asit ile E.coli BW25113 suşu NMR analizi sonrası istatistiksel analizlerde Sükroz, IMP, Pantotenat, Kreatin, Mannitol, Uridin, Glisin, Adenozin, Sitidin, Histamin, Putresine, N6-Acetillizin, 2-Aminobutirat, dTTP, Ksantin, 2-Oksoizokaproat, Asetamid, Inozin, Hydroksiaseton, Glikolat, Guanozin, Kreatin fosfat, Betain ve Malat metabolit konsantrasyonlarında kontrol grubuna kıyasla anlamlı değişimler olmuştur. Benzoik asit ile E. coli BW25113 suşunun NMR analizinde "Galaktoz (Galactose)", "Nişasta ve sükroz (Starch and sucrose)", "Pürin (Purine)", "Pirimidin (Pyrimidine)" ve "Glisin, serin ve treonin (Glycine, serine and threonine)" metabolik yolaklarının etkilendiği görülmüştür. Ferulik asit ile yapılan NMR analizi sonucu 71 adet metabolit profiline ulaşılmıştır. 71 adet metabolit ile yapılan istatistiksel analizler sonucu 41 adet metabolit konsantrasyonunda, en az bir ferulik asit uygulamasında kontrol grubuna kıyasla değişim olduğu görülmüştür. Anlamlı değişim gözlenen metabolitler, Asetamid, Fumarat, Urasill, Oksipürinol, N-Asetilornitin, Glikolat, Eritritol, Süksinat, Trimetilamin N-oksit, Hidroksiaseton, N-Asetilglukozamin, Piroglutamat, Betain, Izositrat, Malat, dTTP, Niasinamid, Etilen glikol, Piruvat, Fruktoz, Adenozin, AMP, Kreatin fosfat, Inozin, Histamin, O-fosfokolin, Sitidin, Sitozin, Maleat, Piridoksin, Metiyonin, Glutamat, Malonat, Kadaverin, Guanozin, Alanin, Tartarat ve Sebakat' dır. Ferulik asit ile E.coli BW25113 suşunun NMR analizinde etkilenen metabolik yolaklar , "Trikarboksilik asit döngüsü (TCA cycle)", "Glutatyon (Glutathione)", "Propanoat (Propanoate)", "Sülfür (Sulfur)", "Metan (Metan)", "Bütanoat (Butanoate)", "Arjinin biyosentesi (Arginin biosynthesis)", "Nikotinat ve nikotinamid (Nicotinate and nicotinamide)", "Lizin degredasyonu (Lysin degradation)", "Alanin, aspartat ve glutamat (Alanin, aspartate and glutamate)", "Piruvat (Pyruvate)", "Glioksilat ve dikarboksikat (Glyoxylate and dicarboxylate)", "Glikoliz/glikoneogenez (Glycolysis/gluconeogenesis)", "Pürin (Purine)", "Glisin, serin ve treonin (Glycin, serine ve threonine)", "Pirimidin (Pyrimidine)", "Fruktoz ve mannoz (Fructose ve mannose)" ve "Nişasta ve sükroz (Starch and sucrose)"'dur. Bu tez çalışmasıyla, benzoik asit ve ferulik asit'in E. coli bakterisinde doğrudan veya dolaylı ilişkili olabileceği gen ve metabolitler önerilmiştir. Anahtar kelimeler: Benzoik asit, Ferulik asit, ASKA, Escherichia coli, gen, metabolit