Over kanser tedavisinde reseptör hedefli in siliko ligand tasarımının in vitro incelenmesi

İnsan östrojen reseptör alfa (ERα), büyüme, metabolizma ve gelişimde rol oynayan östrojenle indüklenebilen birçok genin transkripsiyonunu düzenleyen bir nükleer reseptör ailesi üyesidir. ERα'nın dokularda aşırı ifade edilmesi ilişkili olduğu sinyal yollarını aktive etmesine neden olarak, hücrede DNA mutasyonlarının birikmesine, çoğalan hücrelerin neoplastik dönüşümüne ve tümörün ilerlemesine yol açar. Özellikle ERα ekspresyonu ve aktivasyonu hormona bağımlı kanser türlerinin gelişimi için birincil öneme sahiptir. Hormona bağımlı kanser tedavisinde ERα'yı hedefleyen çalışmalar, hücrelerde apoptozu uyarması ve epitelyal mezenkimal geçişi inhibe etmesiyle kanser tedavisinde uygun bir terapötik hedef olduğunu göstermiştir. Ancak endokrin tedavisine karşı zamanla gelişen direncin üstesinden gelebilmek için ERα'ya yönelik alternatif yaklaşımlar ligand bağlama alanınından çıkıp ERα-DNA veya ERα-kofaktör etkileşimleri (reseptör kutusunun (NR) LxxLL motifinin hidrofobik oyuk) üzerinde yoğunlaşmaktadır. Hedefli tedavilerde özellikle son yıllarda, terapötik peptitlerle, ERα-kofaktör etkileşimleri gibi protein-protein etkileşimlerinin (PPI) inhibe edilmesi hastalıkların tedavisinde genel bir strateji haline gelmiştir. Lineer peptit motiflerine göre farmakolojik açıdan daha yüksek performans gösteren, hedefe daha iyi bir afinite ile bağlanan kıstırılmış (siklik) peptitler, yeni ve hedefe yönelik inhibitörler olarak kapsamlı bir şekilde son yıllarda araştırılmaktadır. Bu yüzden bu tez çalışmasında; ERα'da yer alan çeşitli α-sarmal baskın protein-protein etkileşimlerini hedefleyen siklik peptitler, kofaktör bağlanma inhibitör bölgesi (LxxLL) baz alınarak tasarlanmıştır. Bu bölgeye özgü gerçekleştirilen in siliko çalışmalarımızda, ERα'ya bağlanan en kritik amino asitlerin kıstırılmadığı, aksine serbest bırakıldığı siklik peptit tasarımının mümkün olduğu gösterilmiştir. Bu sayede, yeni dizayn edilen siklik peptitler, ERα'ya hem özgün hem de biyoeşdeğerliği yüksek bir biçimde bağlanan, literatürde sunulan motiflere büyük bir üstünlük sağlayacak şekilde in siliko olarak hesaplanmıştır. Referans siklik peptit (SP1) ile tez kapsamında türetilen yeni siklik peptitler (SP2 ve SP3) Fmoc kimyası kullanılarak, katı-faz peptit sentez yöntemi ile sentezlenmiş ve DEAD yöntemi ile halkasallaştırılmıştır. Elde edilen lineer ve siklik ham peptitler LC-MS ile analiz edilip, karakterize edildikten sonra ters faz HPLC ile saflaştırılmış ve in vitro deneylerde kullanılmıştır. Tez çalışmasında ERα inhibitörü olarak TPBM ticari küçük molekülü, östrojen ile rekabet etmeden ERα'ya karşı peptitlerimiz ile benzer etki mekanizmasına sahip olduğu için referans molekül olarak kullanılmıştır. Gerçekleştirdiğimiz in vitro çalışmalar neticesinde tasarladığımız yeni siklik peptitlerin sadece aktif formadaki ERα (östrojen (E2) ile kompleks haline gelmiş) üzerinde etkili olduğu, E2'den yoksun ortamdaki siklik peptitlerin ERα (+) hücrelerinde herhangi bir etkisi olmadığı gözlemlendi. Bu durum siklik peptitlerin tasarımında, sadece ERα'nın aktif formunda açığa çıkan LxxLL motifine bağlandığının göstergesi olmuştur. Aynı zamanda E2 ile desteklenmiş hücre kültürü ortamında SP'lerin ERα eksprese etmeyen kanser ve sağlıklı hücre hatlarında herhangi bir toksik etki gösterememiş sadece ERα eksprese eden hücreler üzerinde antiproliferatif etki göstermiş olması, peptitlerin ERα üzerinden hücre büyümesini inhibe ettiğini desteklemiştir. Ayrıca oluşturulan peptit kombinasyonlarının hücre hatları üzerinde antiproliferatif ve toksik etki gösterdiği hücre canlılık testleri vasıtasıyla belirtilmiştir. En etkili kombinasyon grubun SP2 + SP3 ve SP1 + SP2 + SP3'ün hücrelerin ERα ile ilişki yolaklarında ve önemli apoptoz belirteçleri üzerindeki etkisi de hem gen hem de protein bazında açığa çıkarılmıştır. qPCR ve Western Blot'tan elde edilen veriler içsel apoptoz yolunda rol oynayan p53, p21, Bax ve Bcl-2 'nin yanı sıra dışsal apoptoz yolunda rol oynayan kaspaz-8'in değişen ekspresyon profilleri hücrelerin siklik peptit kombinasyon tedavasi sonrası her iki apoptoz yolu üzerinden etkileyebileceğini göstermiştir. Yapılan akış sitometrisi analizleri ile etkili kombinasyonlarla tedavi edilen hücrelerdeki kaspaz 3/7 aktivitesinin artışı ile Annexin V belirteçlerinin aşırı ifadesi hücreleri yoğun olarak erken ve geç apoptoza sürüklediğini desteklemiştir. Bunlara ilateven, Bcl-2 ekspresyonunun ve mitokondriyel membran bütünlüğünün ölçüldüğü akış sitometrisi analizlerinde siklik peptit kombinasyon tedavisi sonrasında hücrelerde Bcl-2 inaktivasyonun ve mitokondiryel memebran bütünlüğü bozulmuş hücre sayısındaki anlamlı artışlar Bcl-2 sinyal yolunun etkisiz hale getirildiği ve apoptozun mitokondri yoluyla gerçekleştiğini kanıtlamıştır. Ayrıca hücrelere sadece peptit ve peptit kombinasyonları uygulandıktan sonra hücre içinde dağılım gösteren sitoplazmik ve nükleer ERα aktivasyonlarında düşüşün meydana gelmesi siklik peptitlerin ERα'ya spesifik olduğunu kanıtlar nitelikte olmuştur. Buna ek olarak, MCF-7 hücrelerinin proliferasyonunda önemli bir rolü üstlenen hatta hormon direnci ile güçlü bir ilişkisi bulunan sitoplazmik ERα'nın, siklik peptit tedavisinden sonrasında aktivitesinin çarpıcı bir şekilde azalmasının apoptozun bu yolak üzerinden indüklediği ilgi çekici bir bulgu olarak elde edilmiştir. Sonuç olarak bu tez çalışması kapsamında, ERα hedeflemesi için siklik peptitler tasarlanmış, sentezlenmiş ve ERα(+) hücreleri üzerindeki inhibitör etkisi çeşitli in vitro çalışmalarla desteklenmiştir. Sonuçlarımızda siklik peptitlerin hücrelerin hem içsel hem de dışsal apoptoz yolunda etkili olarak hücrelerin ölüm mekanizmalarını indüklediği sunulmuştur. Bu tez kapsamında geliştirdiğimiz yeni siklik peptitlerin, yeni teknolojilerle daha da iyileştirilmesinin mümkün olduğunu ve hali hazırdaki klinik tedavilere alternatif ya da yeni peptit kombinasyon tedavilerinin oluşturulmasında yardımcı bir yaklaşım olabileceğini göstermekteyiz.